В традиционных доклинических токсикологических исследованиях в качестве модельных организмов используются животные. Однако после внедрения принципов 3R (Replacement, Reduction, Refinement — замена, сокращение, совершенствование), принятых учеными как моральное обязательство гуманно обращаться с животными, логичным шагом явилась разработка альтернативных моделей in vitro для изучения токсичности химических веществ [1][2]. Необходимость разработки таких моделей обусловлена, кроме того, высокой стоимостью, длительностью и трудоемкостью исследований in vivo, а также сложностью экстраполяции данных на человека, связанной с генетической однородностью лабораторных животных (в пределах вида) и гетерогенной популяцией человека [3–5]. Переходу от in vivo к in vitro и in silico исследованиям способствует прогресс, достигнутый токсикологией за последние десятилетия: клонирование генов, экспрессирующих белки для регуляции биотрансформации химических веществ, получение трансгенных и нокаутных животных и изучение с их помощью роли специфических генов в токсических эффектах химических веществ, стремительное развитие геномики, протеомики, метаболомики, интерактомики, эпигенетики, системной, вычислительной и in vitro биологии [6][7].

В 2007 г. Национальный исследовательский совет США (National Research Council, NRC) разработал программу «Токсикология в 21 веке» (Toxicology in the 21st Century)1, в которой были представлены рекомендации по переходу от традиционных подходов к исследованию токсичности на животных к альтернативным методам, основанным на изучении нарушений молекулярных событий и клеточных путей с использованием in vitro анализов биологического (человеческого) материала и новых методов биоинформатики. Программа направлена на разработку инновационных методов испытаний, включающих использование технологий qHTS, биоинформатики, тестов in vitro, а также других новых методологий подхода к оценке безопасности химических веществ для человека и окружающей среды.

Цель работы — обзор информации об альтернативных моделях in vitro, разработанных для изучения токсичности химических соединений в рамках программы «Токсикология в 21 веке».

В разработке и поддержке программы «Токсикология в 21 веке» приняли участие Агентство по охране окружающей среды США (Environmental Protection Agency, EPA), Национальная токсикологическая программа (National Toxicology Program, NTP) со штаб-квартирой в Национальном институте по изучению влияния экологических факторов на здоровье человека (National Institute of Environmental Health Sciences, NIEHS), Национальный центр развития трансляционных наук (National Center for Advancing Translational Sciences, NCATS) и Управление по контролю за качеством продуктов питания и лекарственных средств (Food and Drug Administration, FDA) [8][9]. Этот консорциум, неофициально называемый «Tox21» — «Токсикология в 21 веке», был создан для решения следующих задач:

Исследования программы Tox21 были разделены на 3 этапа (табл. 1).

На первом этапе (до 2010 г.) партнеры Tox21 использовали технологию высокопроизводительного скрининга (quantitative high-throughput screening, qHTS) для тестирования около 2800 соединений в более чем 75 анализах, проведенных в Национальном центре химической геномики США (National Chemical Genomics Center, NCGC; ныне часть NCATS). За это время Национальный центр вычислительной токсикологии Агентства по охране окружающей среды с помощью программы ToxCast™ также проверил 309 уникальных соединений в более чем 500 биохимических тестах3. Эти соединения также были протестированы в лаборатории WormTox в NTP. Так началось создание библиотеки химических соединений.

На втором этапе (до 2014 г.) партнерами Tox21 проанализировано 200 баз данных химических веществ и лекарственных препаратов в США и за рубежом, выбраны и протестированы перспективные соединения. В этот период участники Tox21 создали полный спектр клеточных тестов для дальнейшего определения и характеристики активности, выявленной в первоначальных тестах qHTS. Полученные результаты могут быть использованы для оценки неблагоприятного влияния химических веществ на биологические процессы, влекущие за собой нарушения здоровья человека. В 2012 г. участники консорциума заявили о завершении формирования основной части библиотеки Tox21 10К [10], но сбор и публикация данных qHTS продолжались до 2019 г., и библиотека постоянно пополнялась.

С 2014 г. по настоящее время исследования Tox21 находятся на III этапе. Усилия специалистов программы направлены на разработку тестов in vitro, наиболее полно отражающих функционирование здорового организма человека и изменения, возникающие при различных болезнях. Партнеры Tox21 разработали «Федеральную программу США по Tox21: стратегический и оперативный план дальнейшего лидерства» [8]. В этом документе были определены пять ключевых направлений для реализации программы4:

Одним из конкретных направлений, выделенных NTP на III этапе выполнения Tox21, является увеличение биологического разнообразия клеточных линий человека, используемых в тестировании соединений с помощью qHTS. Кроме того, NTP исследует как монослойные, так и трехмерные (3D) клеточные системы. Эти 3D-модели используются при изучении метаболизма и позволяют оценить влияние химических веществ на биологические системы. Еще одной задачей Tox21 на III этапе является скрининг экспрессии генов для получения информации из всего транскриптома (то есть всех экспрессированных молекул РНК в клетке или биологическом образце) о реакции биологических систем на воздействие химических веществ (токсикогеномика). Один из подходов в этом проекте — разработка гибридного метода отбора генов для создания целевого набора генов и его использования в высокопроизводительной транскриптомике [11].

Традиционные методы изучения токсичности потенциальных лекарственных препаратов, которые используются разработчиками, как правило, оценивают одно химическое соединение в течение месяцев или даже лет. Чтобы ускорить этот процесс, партнеры консорциума Tox21 создали библиотеку соединений, называемую «библиотекой Tox21 10K», которая включает информацию о 10 000 химических веществ, и число их постоянно увеличивается [10]. Каждый из участников программы Tox21 — EPA, NTP и NCATS — привнес отдельные, частично перекрывающиеся библиотеки соединений, что позволило сформировать полную базу данных для скрининга, характеризующуюся широкой разновидностью химических структур, особенностей и свойств веществ, конечных точек для оценки их токсичности. Это самая большая библиотека соединений, когда-либо созданная специально для улучшения понимания химических основ токсичности в научно-исследовательской работе и при создании нормативно-правовой базы, регламентирующей вопросы разработки и применения химических веществ, которые могут иметь потенциальное воздействие на здоровье человека [10].

Отличительной чертой библиотеки Tox21 10K является ее доступность, что позволяет обеспечивать информационную поддержку фундаментальным исследованиям в области медицины. Библиотека представлена на структурно-ориентированной химико-информационной платформе PubChem5, это первая крупная общедоступная финансируемая государством работа по созданию и публикации результатов биоанализа с применением технологий qHTS [10]. Участники консорциума Tox21 и другие разработчики лекарственных препаратов используют библиотеку для быстрого и эффективного исследования потенциальных токсических эффектов химических соединений. Кроме того, библиотека Tox21 10K включает фармацевтическую коллекцию NCATS (данные о группе соединений, составляющей более 90% от всех одобренных FDA препаратов), поэтому исследователи Tox21 могут напрямую тестировать токсические эффекты лекарственных средств, уже выведенных на фармацевтический рынок.

Разработчики Tox21 10K предлагают использовать представленную информацию для создания моделей, позволяющих прогнозировать токсичность химических веществ до того, как будут проведены экспериментальные исследования. Библиотека может обеспечить качественный набор данных для обучения вычислительных моделей в области биоинформатики, компьютерного моделирования и прогнозирования. Участники консорциума Tox21 провели конкурс Tox21 Data Challenge 20146, в рамках которого ученые работали над созданием наиболее точных прогностических моделей с использованием Tox21 10K. В нем приняли участие более 100 команд со всего мира, а модели, набравшие наибольшее количество баллов, показали точность 80–90% при прогнозировании токсичности соединений.

На основе данных Tox21 10К сотрудниками исследовательского центра биоинформатики государственного университета Северной Каролины, США (Research Center for Bioinformatics, North Carolina State University, USA), отдела внутренних исследований / отделения биостатистики и вычислительной биологии NIH (Department of Internal Research / Bioinformatics and Computational Biosciences Branch DIR/BCBB) и NIEHS создан веб-сервер Tox21BodyMap7, позволяющий пользователю идентифицировать органы-мишени в организме человека, на которые исследуемое вещество с большей вероятностью будет оказывать воздействие. Мишени химических соединений, выявленные с использованием данных о тканеспецифической экспрессии генов и высокопроизводительного скрининга, были нанесены разработчиками на карту органов человека. Пользователи могут ввести химическое вещество из библиотеки Tox21 и регулировать пределы экспрессии генов, а также пороговые значения полумаксимальной концентрации активности AC50 для исследования органной специфичности химического вещества. Потенциальными возможностями использования Tox21BodyMap являются определение приоритетных химических веществ, анализ механизмов действия, выявление пробелов в результатах анализов и разработка дизайна исследований in vivo. Однако этот уникальный научный ресурс имеет ряд ограничений, обусловленных, во-первых, неравным количеством проведенных анализов химических веществ, входящих в библиотеку Tox21. Во-вторых, целевое сопоставление результатов тестов проведено только для 33 органов. Важно отметить, что картирование не учитывает характеристики ADME (absorption, distribution, metabolism, excretion), оно отражает потенциальное влияние химических веществ на определенный путь в конкретном органе, что может быть использовано, например, для разработки новых клеточных моделей, но не показывает распределение химического вещества во всем организме [12]. В будущем для совершенствования и повышения эффективности такого подхода могут быть исследованы альтернативные ресурсы, включая экспрессию белков (например, Human Protein Atlas) и РНК (например, Genotype-Tissue Expression, GTEx). Можно ранжировать органы по типам тканей, а также учитывать половые различия, которые могут влиять на эффекты химических веществ [12].

Использование технологии qHTS in vitro для тестирования химических соединений, включенных в Tox21 10K [13], обусловлено возможностью с высокой скоростью проводить скрининг десятков тысяч соединений при различных концентрациях (как правило, 15 концентраций, от ~0,5 нМ до ~92 мкМ), чтобы получить кривые «концентрация–ответ», определяющие активность соединения. Таким образом были идентифицированы вещества с широким спектром эффектов и низким уровнем ложноположительных или ложноотрицательных результатов [14]. Применение qHTS было направлено на устранение неспособности традиционных методов тестирования токсичности справиться со все возрастающим объемом химических веществ, по которым отсутствовали данные о безопасности, и биологических путях, по которым реализуется их негативное действие [10]. Например, в Реестре Закона о контроле за токсичными веществами (Toxic Substances Control Act Inventory, TSCAI) EPA в 1982 г. насчитывалось около 62 000 химических веществ, а в настоящее время их уже около 85 0008.

Программа Tox21 с начала своей реализации стала мировым лидером в создании и применении qHTS [10]. Результаты этих исследований были успешно использованы для быстрой оценки активности и токсичности лекарственных препаратов, которые применялись в комплексной терапии COVID-19 в период пандемии. В тестах qHTS была проанализирована эффективность препаратов в отношении различных мишеней и сигнальных путей, задействованных при проникновении вируса в клетку и его репликации, процессах воспаления и острых повреждениях легких [15].

Выявлено, что бромгексин, будесонид, флувоксамин и нитазоксанид, использовавшиеся при COVID-19 в качестве потенциальных лекарственных средств, оказывали положительные эффекты за счет уменьшения вирусной нагрузки, а колхицин, иматиниб и никлозамид способствовали облегчению симптомов заболевания. Их эффекты были опосредованы модуляцией сигнальных путей ядерных рецепторов, включая Nrf2/ARE (nuclear factor-erythroid factor 2-related factor 2 / antioxidant response element), уменьшением стресса эндоплазматического ретикулума и влиянием на такие мишени, как HDAC (histone deacetylase), путем изменения регуляции экспрессии ангиотензин-превращающего фермента 2-го типа (angiotensin-converting enzyme 2, ACE2) и TMPRSS2 (prostate-localised and androgen-regulated expression of the membrane-bound serine protease), которые являются основными факторами клетки-хозяина, повышающими патогенность SARS-CoV-2. При этом для некоторых лекарственных препаратов (хлорпромазин, эметин, лопинавир, ритонавир, никлозамид и нитазоксанид) была выявлена цитотоксичность в in vitro исследованиях, что, вероятно, связано с их влиянием на множество мишеней. И хотя цитотоксичность in vitro зарегистрирована при микромолярных концентрациях, результаты указывают на потенциальную опасность многократного применения или высоких доз этих лекарственных препаратов [15].

Для изучения действия химических соединений программа Tox21 рекомендует использование клеток человека во всех случаях, когда это возможно, чтобы устранить видовые различия в ответной реакции. При разработке in vitro тестов участники консорциума первоначально анализировали цитотоксичность 1408 соединений, ранее изученных в одном или нескольких традиционных токсикологических тестах, на 13 типах клеток (9 человеческих, 2 крысиных и 2 мышиных) [16]. Использовали клеточные линии, штаммы и первичные клеточные популяции разных тканей. В тестируемом диапазоне концентраций были соединения, обладающие цитотоксичностью как для всех типов клеток, так и только для одного или нескольких. Аналогичные данные были получены при скрининге соединений, влияющих на апоптоз [17]. Эти результаты показали, что ни одна из разновидностей клеток не может быть универсально информативной в отношении цитотоксичности или апоптоза, но использование нескольких типов клеток позволяет объединять соединения в группы по характеру реакции [16][17].

Также изучалось влияние химических веществ на внутриклеточные стрессорные пути и активность ядерных рецепторов. Среди стрессорных путей рассматривались повреждение ДНК, стресс эндоплазматического ретикулума, тепловой шок, воспалительная реакция, повреждение митохондрий. Такой подход основывался на предположении, что соединения, которые индуцируют одну или несколько реакций на стресс, более вероятно будут проявлять in vivo токсичность, чем те, которые не индуцируют подобную реакцию. Для тестирования были выбраны ядерные рецепторы человека (андроген, арилуглеводород, эстроген-α, фарнезоид X, глюкокортикоид, X-рецептор печени, пролифераторы пероксисом-α, -δ и -γ, прогестерон, прегнан X, ретиноид X, тироид-β, витамин D) в связи с ключевой ролью, которую они играют в эндокринных и метаболических путях передачи сигналов [18]. Усилия Tox21 направлены на выявление максимального количества молекулярных внутриклеточных путей, нарушение которых под действием химических соединений приводит к возникновению вредных для здоровья человека эффектов и неблагоприятных последствий для организма. На основе информации об этих путях разрабатываются комплекты тестов для проведения экспериментов и оценки нарушений в ключевых путях токсичности на моделях клеточных линий предпочтительно человеческого происхождения [6][19].

В рамках программы Tox21 разработан протокол анализа калиевых ионных каналов hERG на клетках линии U2OS остеосаркомы человека, стабильно экспрессирующей эти каналы [20]. В этой связи наиболее подходящих для идентификации химических соединений, ингибирующих их активность. Метод используется для прогноза кардиотоксичности химических веществ [21]. Изоформа Kv11.1 у человека, кодирующаяся геном hERG (human ether-à-go-go-related gene), в последние годы вызывает повышенный интерес, поскольку ее дисфункция связана с синдромом удлиненного интервала QT (long QT syndrome, LQTS), вызывающим желудочковую аритмию типа «пируэт» (torsades de pointes), фибрилляцию желудочков и внезапную смерть [22]. Поскольку синдром удлиненного интервала QT может быть результатом лекарственной блокады канала [23], hERG признан основной антимишенью при скрининге препаратов-кандидатов. Выбор клеточной линии человека для оценки кардиотоксичности обусловлен также различиями в формировании потенциала действия у человека и грызунов [24]. Основные несоответствия связаны с разнообразием распределения и плотности калиевых каналов и характером их открытия во время фазы реполяризации [25].

Выявлено, что лекарственные препараты из нескольких классов, включая антигистаминные [26], антиаритмические [27], нейролептики [28], противомалярийные [29], антибиотики [30], гастропрокинетические [31], вызывают синдром удлиненного интервала QT, связанный с hERG. В США с 1953 по 2013 г. около 30% лекарственных средств было изъято из обращения из-за развития этой нежелательной реакции [32]. Примером является терфенадин, антигистаминный препарат, отозванный с рынка FDA в 1997 г. из-за его способности блокировать hERG [33]. В настоящее время FDA требует оценивать кардиотоксичность всех потенциальных лекарственных препаратов на каналах hERG до проведения доклинических исследований [34][35].

В базе Tox21 Public Available Assays9 имеется протокол изучения влияния лекарственных препаратов на жизнеспособность гепатоцитов (гепатотоксичность), активность каспазы и апоптоз на клеточной линии HepG2 гепатоцеллюлярной карциномы человека с высокой степенью дифференцировки. Анализ химических веществ из библиотеки соединений Tox21 10K позволил идентифицировать более 800 веществ, в той или иной степени снижающих потенциал митохондриальной мембраны (mitochondrial membrane potential, MMP) в клетках линии HepG2. Использование данного показателя для скрининга токсичных веществ обосновывается тем, что химические соединения, любыми путями воздействующие на функции и структурную целостность митохондрий, в конечном итоге изменяют ММР. В процессе скрининга идентифицировано несколько структурных мотивов, возможно потенциальных токсикофоров, в структуре химических веществ, наиболее часто связанных со снижением ММР, что может служить дополнительным маркером для выявления соединений, обладающих токсическим действием [36].

Широко используется протокол анализа жизнеспособности в отношении нормальных клеток человека в реальном времени с использованием клеточной линии HEK293, полученной из эмбриональных клеток почки человека. HEK293 наиболее широко используется среди клеточных линий человека10 благодаря ее высокой трансфективности, быстрой скорости роста и способности расти в бессывороточной суспензионной культуре [37].

Использование клеточных культур для изучения токсичности лекарственных препаратов имеет ряд недостатков, ограничивающих их применение. Например, линии клеток печени для изучения гепатотоксичности: HepG2 не экспрессирует цитохромы P450 [38], HepaRG не производит мочевину в определяемых концентрациях [39], первичные гепатоциты человека (primary human hepatocytes, PHH) являются наиболее универсальной моделью клеток печени [40], однако быстро подвергаются дедифференцировке в 2D-культуре [41], теряют метаболическую активность и не делятся in vitro, что затрудняет получение большого количества клеток линии PHH для высокопроизводительного скрининга. Человеческие плюрипотентные стволовые клетки (pluripotent stem cells, PSC) привлекают внимание исследователей способностью бесконечно размножаться и дифференцироваться в гепатоцитоподобные клетки in vitro, однако они имеют незрелый фенотип [42][43]. Кроме того, печень состоит из нескольких типов клеток, включая холангиоциты, звездчатые клетки, клетки Купфера и синусоидальные эндотелиальные клетки. Каждый из этих типов клеток играет определенную роль в регуляции функции печени [44].

Модели на основе изолированных клеточных культур являются недостаточно эффективными из-за отсутствия физиологически релевантной трехмерной тканевой среды [45][46]. В этой связи были созданы клеточные культуры c трехмерным каркасом для имитации архитектуры тканей in vivo, а затем и микроинженерные конструкции на основе законов микрогидродинамики, объединяющие несколько типов клеток — так называемые органы-на-чипах. Они вошли в список 10 лучших новых технологий, способных оказать наибольшее влияние на решение проблем медико-биологической науки. Благодаря сочетанию клеточной биологии, инженерии и технологии биоматериалов микросреда чипа имитирует микроокружение органа с точки зрения взаимодействия тканей и механической стимуляции. Такая конструкция отражает структурные и функциональные характеристики тканей человека и позволяет прогнозировать реакцию на множество стимулов, включая лекарственные средства и воздействие окружающей среды [45][47]. Уникальным преимуществом органов-на-чипах является возможность интегрировать процессы метаболизма и токсичности лекарственных препаратов в одном устройстве, что облегчает оценку безопасности их метаболитов [48].

Участники консорциума Tox21 NCATS и FDA в сотрудничестве с другими институтами и центрами NIH возглавляют программу Tissue Chip for Drug Screening11 по разработке чипов тканей человека, которые моделируют структуру и функции человеческих органов (легкие, печень, сердце) для более быстрого и эффективного прогнозирования безопасности лекарственных средств.

Разработка печени-на-чипе позволила успешно воспроизвести и изучить различные варианты гепатотоксичности (гепатоцеллюлярное повреждение, стеатоз, холестаз и фиброз) с использованием клеток разных видов (крысы, собаки и человека) [49]. Так, с помощью печени-на-чипе была показана гепатотоксичность для человека противогрибкового препарата тербинафина [50].

Для обнаружения лекарственно-индуцированной нефротоксичности была разработана высокопроизводительная 3D микрожидкостная платформа на чипе Nephroscreen [51]. Она может включать либо линию клеток почечных канальцев человека ciPTEC-OAT1, условно иммортализованные эпителиальные клетки проксимальных почечных канальцев (proximal tubule epithelial cell, PTEC) с повышенной экспрессией транспортеров органических анионов 1 (OAT-1), либо линию RPTEC (primary renal proximal tubule epithelial cells), контрольные клетки, клон SA7K. Отбор клеточных линий имел важное методологическое значение: обе были человеческие и подходили для тестирования со средней и высокой пропускной способностью. Линия ciPTEC-OAT1 обладает чувствительностью к анионным веществам, а клетки RPTEC показали очень хорошие результаты при оценке межлекарственных взаимодействий. Надежность и сопоставимость результатов, полученных с использованием модели Nephroscreen, была успешно подтверждена в нескольких лабораториях для четырех модельных препаратов: цисплатина, тенофовира, тобрамицина и циклоспорина А, которые влияют на проксимальные канальцы [51][52].

Для изучения заболеваний сердца и кардиотоксичности химических веществ были разработаны модели сердца-на-чипе на основе человеческих культур клеток, поскольку между клетками сердца животных и человека имеется значительная разница [53–55]. Основные различия связаны c К+- каналами IKto и IKur, которые оказывают влияние на реполяризацию желудочков у крыс и мышей, а у людей она в большей степени зависит от IKr и IKs. Это несоответствие приводит к формированию зубца J вместо сегмента ST и нечеткому зубцу T на электрокардиограмме мыши [25]. Также имеются противоречивые данные о зависимости между интервалом QT и частотой сердечных сокращений у грызунов, в то время как у человека частота сердечных сокращений в значительной степени влияет на потенциал действия и QT [24].

Различия в типе и характере активации калиевых каналов при развитии потенциала действия у крысы/мыши и человека являются важнейшим ограничением использования мышиных моделей при изучении кардиотоксичности лекарственных препаратов. Одним из вариантов преодоления таких ограничений было создание сердца-на-чипе путем культивирования кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток hiPSC-CM, на мягком микроформованном желатине, что позволяло сформировать структуру, напоминающую нативную архитектонику миокарда человека. Данную систему использовали для исследования кардиотоксичного пролекарства терфенадина и его нетоксичного метаболита фексофенадина [56]. Сердце-на-чипе, созданное путем инновационной технологии 3D-биопечати и содержащее кардиомиоциты человека, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, применяли для оценки токсических эффектов цитостатического препарата доксорубицин [57].

Разработано большое количество моделей чипов гематоэнцефалического барьера, что связано с его важной ролью в доставке многих нейроактивных терапевтических соединений, а также в развитии многих неврологических заболеваний [58–60]. Создана почка-на-чипе, выстланная первичным эпителием проксимальных канальцев, который экспрессирует белок транспортер P-гликопротеин, представляющий собой АТФ-зависимый насос для ксенобиотиков. Данную модель использовали для исследования токсичности цисплатина. Важно отметить, что результаты анализа токсичности цитостатика и активность P-гликопротеина, измеренные с использованием модели на чипе, лучше коррелировали с ответами in vivo, чем результаты, полученные при использовании монослойного культивирования клеток [61]. Существуют и другие органы-на-чипах, например, кишечник, легкие [46][48][62].

Мультиорганы-на-чипе, иначе называемые человек-на-чипе, позволяют изучить токсическое действие лекарственных препаратов одновременно на несколько органов. Например, при изучении влияния препарата на миокард сердце соединяют флюидным каналом с печенью-на-чипе, чтобы можно было одновременно оценить гепатотоксичность [63]. Разработанные к настоящему времени модели могут иметь от 2 до 10 различных органов-на-чипе и обеспечивать имитацию сложных физиологических и патофизиологических реакций [64]. Например, в работе S.Y. Chang и соавт. [65] была использована комплексная модель взаимодействующих друг с другом почки и печени-на-чипе для определения механизмов биоактивации и транспорта аристолоховой кислоты (соединения, обладающего доказанными нефротоксичными и канцерогенными свойствами). Модель легкие + печень-на-чипе была протестирована при добавлении в систему известного канцерогена афлатоксина В1. Печень-на-чипе детоксицировала это вещество, в результате чего клетки бронхов пострадали в гораздо меньшей степени, чем в случае добавления к ним токсина в той же концентрации в отсутствие клеток печени в системе [66][67].

Несмотря на успешно проводимые исследования, использование органов-на-чипе до настоящего времени не регламентировано нормативными документами по регистрации лекарственных средств [68]. Необходимым условием для их полного внедрения в доклинические исследования безопасности и эффективности лекарственных препаратов является соответствие таким критериям, как валидность, надежность, чувствительность.

Для преодоления ограничений, возникающих при использовании клеточных моделей для изучения токсичности, при поддержке участников программы Tox21 NIEHS, NTP, NCATS разрабатываются органоиды. Они представляют собой миниатюрные органы, полученные из стволовых клеток взрослых тканей (adult tissue-resident stem cells, ASC) или PSC in vitro [69] и формируются как трехмерные (3D) тканеподобные структуры за счет их самоорганизации, самообновления и способности к дифференцировке [70]. Органоиды анатомически и функционально близки к органам живого организма [71]. С использованием этой методологии была проведена оценка 238 препаратов, в том числе 32 отрицательных контроля и 206 зарегистрированных лекарственных средств, обладающих гепатотоксичностью [72]. В качестве показателей служили транспортная активность желчных кислот и жизнеспособность клеток. Результаты показали высокую степень прогноза токсичности с чувствительностью 88,7% и специфичностью 88,9%. Обнаружено также, что холестаз, вызванный бозентаном, ассоциирован с полиморфизмом CYP2C9*2, то есть при использовании органоидов печени человека может быть выявлена различная чувствительность к лекарственному препарату, основанная на генетическом полиморфизме [72].

Токсичность лекарственных препаратов, в том числе представленных на фармацевтическом рынке, изучается также с использованием разработанных участниками программы Tox21 органоидов сердца, почек, кишечника и мозга. Однако в настоящее время не существует стандартизированного метода прогнозирования лекарственной безопасности на органоидах, и количество отчетов, описывающих такие исследования, ограничено. Тем не менее попытки использования таких моделей не прекращаются [73][74].

Консорциум Tox21 разрабатывает новые технологии, которые обеспечивают мультиплексное считывание изменений в глобальном транскриптоме. Транскриптомика стала использоваться токсикологами в контексте токсигеномики, представляющей собой совокупность технологий, применяемых в токсикологии для анализа экспрессии генов. Профилирование генов и белков в результате токсикогеномных исследований позволяет получить новую информацию о тех частях генома, которые реагируют на повреждение токсическими веществами, а не изучать гены по отдельности. Основная цель токсикогеномики — выявление новых биомаркеров и генных сигнатур токсичности химических веществ, которые позволят классифицировать токсиканты в соответствии со степенью риска для здоровья, выявлять потенциальные побочные эффекты задолго до того, как будут обнаружены какие-либо патологические изменения, и проводить мониторинг безопасности применения лекарственных препаратов значительно точнее, чем существующие индикаторы [75].

Ключевой проблемой токсикогеномики является низкая воспроизводимость результатов из-за того, что данные получены с использованием разных клеточных линий в разных лабораториях с разными технологиями, используемыми геномными платформами и методами анализа полученных результатов [76]. Организация экономического сотрудничества и развития (Organisation for Economic Cooperation and Development, OECD) предприняла попытку применить принципы надлежащей лабораторной практики (Good Laboratory Practice, GLP) в токсикогеномике и начала разработку стандартного протокола проведения исследований по скринингу токсичных соединений12. Однако даже при стандартном GLP-подобном протоколе дифференциально экспрессируемые гены (ДЭГ) могут значительно различаться в зависимости от выбора способа обработки данных и статистических методов [76]. Эта так называемая проблема «воспроизводимости вычислений» является серьезной для токсикогеномики. Маловероятно, что удастся разработать единый метод анализа, который универсально подходит для каждого исследования и каждого измеряемого гена. Тем не менее можно следовать общему правилу, предложенному консорциумом контроля качества (MicroArray / Sequencing Quality Control, MAQC/SEQC)13 под руководством FDA — определению воспроизводимого профиля ДЭГ: ранжирование генов по кратности изменения при сравнении с таковыми, не подвергавшимися обработке химическим веществом [77]. Проект MAQC помогает совершенствовать микрочипы и технологии секвенирования нового поколения, а также способствовать их надлежащему применению при обнаружении, разработке и анализе продуктов, регулируемых FDA.

В 2019 г. EPA взяло на себя обязательство сократить испытания на животных и финансирование на одну треть к 2025 г. и полностью отказаться от них к 2035 г. [78]. Для достижения этой цели они поддерживают разработку так называемых «методов нового подхода» (new approach methods, NAM) — любых методов без использования животных, которые могут применяться для предоставления информации токсичности химических соединений [79].

Участники программы Tox21 и другие федеральные структуры США разрабатывают стратегии, при помощи которых можно оценить пригодность альтернативных методов для конкретных целей, устанавливают критерии оценки эффективности и предиктивности методов. Межведомственный координационный комитет по валидации альтернативных методов (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods, ICCVAM)14 проводит научную проверку и техническую оценку альтернативных методов испытаний и способствует интеграции их в практику регуляторной токсикологии США для сокращения или отказа от использования животных [80][81].

В начале 2018 г. ICCVAM опубликовал «Стратегическую дорожную карту по установлению новых подходов к оценке безопасности химических веществ и изделий медицинского назначения в США». Одной из рабочих групп, созданных для ее реализации, является Рабочая группа по острой токсичности (Acute Toxicity Workgroup, ATWG), которая разработала план выявления, оценки и применения новых методологий для замены исследований острой системной токсичности in vivo. Был создан прогностический in silico метод определения острой пероральной системной токсичности, основанный на большом наборе результатов исследований на грызунах и ориентированный на законодательные требования федеральных агентств к безопасности лекарственных препаратов [82].

Обзор методов без использования животных, предложенных для тестирования безопасности, соответствующего нормативным требованиям, представлен на сайте ресурса Системы отслеживания альтернативных методов (Tracking System for Alternative Methods, TSAR)15, предоставленной Справочной лабораторией Европейского союза по альтернативам тестированию на животных (European Union Reference Laboratory for Alternatives to Animal Testing (EURL ECVAM)). TSAR проводит мониторинг статуса альтернативного метода от подачи на валидацию до принятия путем включения в нормативную базу.

Проведенный анализ информации о новых подходах к изучению токсичности химических веществ показал, что специалистами консорциума Тох21 получен, обобщен и проанализирован большой массив данных по альтернативным моделям in vitro и новым технологиям для изучения токсичности химических соединений, в том числе лекарственных средств. Данные созданной в рамках программы Tox21 уникальной доступной исследователям библиотеки, содержащей информацию о 10 000 химических веществ с широким спектром химических структур, позволяют осуществлять быстрый и эффективный скрининг токсичности новых веществ и выявлять побочные эффекты уже используемых лекарственных препаратов.

В рамках программы Тох21 разработаны высокопроизводительные скрининговые in vitro методы, различные модели с использованием клеточных линий человека, тканевых чипов, органоидов, а также омиксных технологий. Результаты исследований, проведенных специалистами консорциума Тох21, подготовили базу для перехода от изучения токсичности химических веществ in vivo к новым in vitro методам, обеспеченным новыми инструментами и технологиями. В рамках программы Tox21 разрабатываются стратегии валидации и имплементации альтернативных методов.

Новые подходы для оценки токсического воздействия на человека химических соединений позволят сократить сроки проведения исследований, а также внедрить методы, дающие возможность значительно уменьшить использование лабораторных животных при разработке лекарственных средств. Однако для полного достижения целей программы Tox21 потребуется еще много времени и усилий международного научного сообщества.

Вклад авторов. Автор подтверждает соответствие своего авторства критериям ICMJE.

Authors’ contributions. The author confirms that she meets the ICMJE criteria for authorship.

1. Toxicology in the 21st Century. https://tox21.gov/ 2. Tox21 Research Phases. https://ntp.niehs.nih.gov/whatwestudy/tox21/phases 3. https://www.epa.gov/chemical-research/exploring-toxcast-data 4. https://ntp.niehs.nih.gov/whatwestudy/tox21 5. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ 6. https://tripod.nih.gov/tox21/challenge/ 7. https://sandbox.ntp.niehs.nih.gov/bodymap/ 8. https://www.epa.gov/tsca-inventory/how-access-tsca-inventory 9. https://tripod.nih.gov/tox/assays 10. https://www.synthego.com/hek293 11. https://ncats.nih.gov/tissuechip 12. https://www.oecd.org/chemicalsafety/testing/toxicogenomics.htm 13. https://www.fda.gov/science-research/bioinformatics-tools/microarraysequencing-quality-control-maqcseqc 14. https://ntp.niehs.nih.gov/go/natl-strategy 15. https://tsar.jrc.ec.europa.eu/