Особенности оценки офтальмотоксичности у лабораторных животныхЛекарственные средства, инстиллируемые в конъюнктивальную полость, могут подвергаться системной абсорбции в объеме 70–80%, при этом биодоступность препарата (концентрация в передней камере глаза) не превышает 5% от введенной дозы [17]. У лабораторных животных (кроликов, крыс, мышей и др.) соотношение «доза введенного препарата — масса тела» выше, чем у человека, и, несмотря на более редкую частоту моргания (с каждым морганием препарат выводится из конъюнктивальной полости вместе со слезой), у лабораторных животных могут развиваться более серьезные системные побочные эффекты [18].
Биодоступность лекарственного средства (активного соединения) находится в прямой зависимости от скорости оттока внутриглазной жидкости, то есть клиренса препарата. При изучении офтальмотоксичности препаратов, вводимых интравитреально, следует учитывать физиологические особенности каждого вида. У человека и кролика близкие значения скорости оттока внутриглазной жидкости (2,8 и 2,7 мл/мин соответственно) и ее среднего объема (310 и 287 мл соответственно) [18]. У крыс и мышей эти показатели ниже в 10 раз. Особенностями строения глаз грызунов, в отличие от других лабораторных животных, является анатомическое соотношение объемов хрусталика и стекловидного тела к размеру глазного яблока: у грызунов хрусталик занимает около 70% объема глаза, тогда как у человека, минипигов и кроликов около 55% объема глаза приходится на стекловидное тело [19].
Глаз является единственным органом, внутреннее строение которого доступно для прижизненного осмотра в исследовании токсичности потенциальных лекарственных средств. Среди лабораторных животных, используемых для изучения ретинотоксичности, наибольшую ценность представляют обезьяны, так как строение макулы у них имеет наибольшее конвергентное сходство с человеком. У приматов, например, может развиваться друзеноидная макулопатия, схожая с дегенерацией сетчатки у человека [13, 20]. Однако из-за высокой стоимости и сложности содержания нечеловеческих приматов, а также этических аспектов использование данных видов лабораторных животных ограничено [21].
Наличие мигательной перепонки или третьего века у млекопитающих, которая отсутствует у человека и приматов, следует учитывать при оценке раздражающего действия на глаза или влияния соединения на слезопродукцию [18]. Воспаленная мигательная перепонка может имитировать гиперемию конъюнктивы или, наоборот, маскировать поражение глазной поверхности. Роговица крысы, мыши и кролика занимает бóльшую площадь передней поверхности глаза по сравнению с глазом человека [22]. При выборе животных для изучения офтальмотоксичности следует учитывать способность некоторых препаратов, особенно для системного применения, связываться с меланином: у животных-альбиносов и животных с пигментированным глазным дном могут быть разные проявления ретинотоксичности [13].
I. Perlman (2009) при изучении офтальмотоксичности рекомендует проводить тестирование как при системном, так и при интравитреальном/субконъюнктивальном введении препарата на двух видах лабораторных животных в связи с возможными особенностями проявлений токсичности, при этом объем проводимых исследований, по мнению автора, следует определять исходя из потребностей экспериментаторов [21].
При исследовании офтальмотоксичности наиболее часто используются крысы-альбиносы, которые из-за отсутствия меланина склонны к развитию атрофии сетчатки, вызванной фотоповреждением [13][20]. У крыс-альбиносов при офтальмоскопии хорошо визуализируются сосудистые сети сетчатки и хориоидеи. При изучении офтальмотоксических эффектов соединений, имеющих сродство к меланину, следует учитывать возможность их накопления в слое пигментного эпителия сетчатки у крыс-неальбиносов, что может влиять на результаты исследований [20]. Аналогично у кроликов выраженность ретинотоксических эффектов гентамицина зависит от состояния пигментации глазного дна [21].
Крысы имеют холангиотический тип васкуляризации сетчатки: сосуды радиально отходят от диска зрительного нерва и равномерно распределяются по глазному дну без создания бессосудистой зоны в центральной области сетчатки, так как не имеют макулы [20]. Для адаптации к ночному образу жизни порядка 99% фоторецепторов крыс представлены палочками, что необходимо учитывать при проведении ЭРГ, так как амплитуды волн скотопической электроретинограммы будут преобладать над фотопическим ответом [21].
Кролики имеют бóльшую площадь конъюнктивы, видимую в просвете глазной щели, по сравнению с нечеловеческими приматами, что следует учитывать при оценке раздражающего действия препаратов на глаза [18]. При гистологическом исследовании энуклеированных глазных яблок у кроликов были обнаружены физиологические передние синехии, что в некоторых участках приводило к органической блокаде угла передней камеры [22]. У кроликов мерангиотический тип кровоснабжения сетчатки с билатеральным выходом сосудов из диска зрительного нерва по горизонтальному меридиану по ходу расположения миелинизированных проминирующих в стекловидное тело пучков нервных волокон. Из-за неразвитой сосудистой сети сетчатки кроликов существуют ограничения экстраполяции данных о ретинотоксичности изучаемого соединения на человека. Диск зрительного нерва кроликов имеет дорсальное расположение (поэтому осмотр глазного дна кроликов удобней проводить в направлении снизу вверх), а также глубокую физиологическую экскавацию, которую трудно дифференцировать от глаукомной вследствие отсутствия развитой решетчатой пластинки. Тапетум у кроликов отсутствует [21].
Преимуществом использования мышей в доклинических исследованиях является доступность трансгенных и нокаутированных линий для изучения механизма действия соединений и их токсических эффектов [21].
Альтернативой грызунам и кроликам при исследовании офтальмотоксичности являются минипиги: помимо доступности, воспроизводимости, экономической составляющей содержания данного вида у минипигов возможно проведение всего комплекса исследований офтальмотоксичности, так как они имеют общие анатомические и функциональные показатели органа зрения, сопоставимые с таковыми у других лабораторных животных [24].
Таким образом, для получения корректных результатов оценки офтальмотоксического действия разрабатываемых лекарственных препаратов на структуры глаза необходимо выбрать метод и вид животного, в наибольшей степени подходящий для реализации цели исследования.
Основные методы диагностики при исследовании офтальмотоксичностиОценка раздражающего глаза действия
Изучение офтальмотоксичности проводится на доклиническом и клиническом этапах исследования нового лекарственного препарата, а также при изучении воздействия на орган зрения растворов для очистки и хранения контактных линз, средств бытовой химии, аэрозолей, пестицидов, продуктов промышленного производства. Главным образом изучают раздражающее или повреждающее воздействие на роговицу и конъюнктиву глазного яблока. В Российской Федерации общепринятым методом исследования раздражающего действия на глаза является конъюнктивальная проба с однократным закапыванием препарата в глаз при изучении острой токсичности1 [25].
Для оценки раздражающего действия веществ на глаза в 1944 г. был разработан тест Дрейза [26]. Процедура включает в себя нанесение 0,5 мл раствора испытуемого вещества в нужной концентрации на один глаз обездвиженного находящегося в сознании животного после предварительной аналгезии. Контролем служит необработанный глаз. Вещество тестируется с помощью поэтапной процедуры с использованием на каждом этапе трех животных одного пола. Для тестирования, как правило, используются кролики-альбиносы, но возможно использование других животных [26].
В качестве альтернативы или частичной замены теста Дрейза, проводимого in vivo, Организацией экономического сотрудничества и развития (Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD) предложено несколько методов тестирования in vitro. В руководстве OECD TG 405 (2023) по оценке раздражения/повреждения глаз химическими соединениями2 подробно описаны программа тестирования и подходы к анализу полученных данных. Этим документом руководствуется Европейское агентство по лекарственным средствам (European Medicines Agency, EMA)3.
В Российской Федерации и ряде других стран действует межгосударственный стандарт «Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Оценка раздражающего/разъедающего воздействия на глаза» (ГОСТ 34658-2020), который по структуре и методике исследования поражения глаз химическими веществами in vivo соответствует международному руководству OECD TG 405.
Стратегия последовательного испытания химических соединений (в том числе разрабатываемых лекарственных средств и их вспомогательных компонентов) для выявления раздражающего/разъедающего действия на глаза, согласно OECD TG 405 и ГОСТ 34658-2020, предполагает 8 этапов, которые подробно описаны в данных документах. В рамках данной стратегии для определения необходимости испытания на глазах in vivo предварительно необходимо изучить и оценить в совокупности всю доступную информацию о воздействии рассматриваемого вещества и его структурных аналогов с использованием анализа весомости доказательств (weight of evidence, WoE). Особое внимание уделяют имеющимся результатам исследований in vitro и ex vivo. Рекомендуется по возможности избегать исследований агрессивных веществ in vivo. Тестирование может быть прервано на любом этапе, если выявлено, что испытуемое вещество обладает высокой токсичностью, раздражающим или разъедающим действием (конечная точка исследования).
Следующим шагом в разработке нормативной базы для выявления раздражающего/разъедающего глаз действия химических веществ стал переход от стратегии последовательного тестирования (OECD TG 405) к новому интегрированному подходу (Integrated Approaches to Testing and Assessment, IATA), рекомендуемому в OECD GD 2634. Интегрированный подход (IATA) предполагает использование структурированных методов, позволяющих объединить и взвесить разные типы данных для идентификации и характеристики опасности для глаз и/или подтверждения безопасности вещества (группы веществ). Для этого используются данные исследований на людях и животных, результаты тестов in vitro и другие источники информации. Если стратегия последовательного тестирования (OECD TG 405) фокусировалась на оценке отдельных данных, то интегрированный подход (OECD GD 263) объединяет их для получения более точной и комплексной оценки опасности веществ (табл. 1, опубликована на сайте журнала5).
Согласно рекомендациям OECD GD 263 тестирование in vivo должно проводиться только после рассмотрения всей имеющейся информации об изучаемом соединении и его тестирования in vitro. На первом этапе проводится сбор и анализ сведений из литературы, баз данных и других надежных источников о физико-химических свойствах изучаемого вещества, случаях серьезного повреждения глаз у людей, результатах токсикологических исследований, о прогнозах in silico токсикологических характеристик этого вещества и др. Второй этап оценки опасности серьезного повреждения и раздражения глаз включает анализ опубликованных данных, полученных в исследованиях in vitro. Третий этап, включающий проведение испытаний на животных (OECD TG 405), предусмотрен только в случае отсутствия нежелательных эффектов после анализа всех данных, полученных на предыдущих этапах.
Эти три этапа, включающие 12 модулей, представлены как последовательность, но риск серьезных повреждений и/или раздражения глаз может быть выявлен на любом этапе, и порядок действий при этом может быть изменен.
Для реализации интегрированного подхода по оценке раздражающего/повреждающего действия веществ на глаза в OECD GD 263 представлены качественные характеристики источников информации (модули с 1 по 8), которые позволяют оценить весомость, объективность и применимость данных о свойствах исследуемого соединения или смеси (по принципу аддитивности ее компонентов). Характеристики включают в себя: категорию вещества, присваиваемую согласно глобальной согласованной системе по классификации и маркировке Организации Объединенных Наций (Globally Harmonized System for classification and labelling, UN GHS)6 исходя из данных, которые содержит научный источник; уровень валидности и принятия нормативных требований регулирующих органов, роль метода исследования в комплексной оценке раздражающего/повреждающего действия на глаза; описание метода тестирования; научную основу метода и механизм повреждающего действия вещества; доступность протокола исследования; сильные и слабые стороны метода; область применения и ограничения метода; прогностический уровень результатов исследования (чувствительность, специфичность, точность метода исследования); оценку внутрилабораторной и межлабораторной воспроизводимости результатов тестирования.
Далее согласно OECD GD 263 должна проводиться задокументированная и обоснованная «оценка весомости доказательств» (модуль 9) данных о раздражающем/повреждающем действии вещества на глаза, полученных из научных источников (модули 1–8). Уровень значимости их влияния на конечный вывод о свойствах исследуемого вещества следующий (от большего к меньшему): данные о раздражении/повреждении глаз у людей (модуль 1) > результаты тестирования на кроликах in vivo (OECD TG 405) и/или in vitro методами, одобренными OECD (модули 2 и 3 соответственно) > данные, полученные из экспериментов на животных или другими методами, не принятыми OECD (модули 4 и 5), информация о повреждающем действии на кожу (модуль 6), физико-химические свойства (модуль 7), данные, полученные нетестовым путем (модуль 8). Если проанализированные данные признаются весомыми, достоверными и актуальными и возможно сделать авторитетное заключение о наличии или отсутствии у изучаемого вещества повреждающего действия на глаза с присвоением ему определенной категории в соответствии с классификацией UN GHS, то дальнейшие испытания не требуются. В противном случае проводят этап 3 исследования вещества (модули 10–12) методами, предусмотренными IATA (табл. 1, опубликована на сайте журнала7).
Диагностические тесты in vivo, используемые в доклинических исследованиях, обладают высокой информативностью, однако для получения корректных результатов оценки токсического действия разрабатываемых лекарственных препаратов на структуры глаза необходимо выбрать метод и вид животного, в наибольшей степени подходящий для реализации цели исследования.
Измерение внутриглазного давления
Метод позволяет оценить способность изучаемого вещества повышать или понижать внутриглазное давление (ВГД) при местном применении, а также выявить его возможное системное действие. При проведении исследования глазных капель один глаз лабораторного животного является опытным, второй — контрольным, в том числе для исключения системной активности действующего вещества [27].
На данный момент существует несколько подходов к измерению ВГД у разных видов экспериментальных животных инвазивными и неинвазивными методами, и их перечень продолжает увеличиваться [28][29].
Инвазивные методы. Методики прямого определения ВГД связаны с канюлизацией глаза, и, следовательно, их недостатками являются необходимость применения анестезии и прокола глазного яблока. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать повреждения радужной оболочки, передней капсулы хрусталика, хрусталика или роговицы. Риск повреждения радужной оболочки может быть уменьшен с помощью местного применения мидриатиков, но это может повлиять на ВГД [30]. Проводимые манипуляции могут повлиять на уровень ВГД, а частота возможных измерений ограничена. Однако это способ измерить фактическое ВГД (истинное, а не тонометрическое), и разброс результатов измерений при этом меньше, чем при использовании неинвазивных методов [31].
В лабораторных условиях, когда одной из основных задач исследования является изучение фармакодинамических параметров потенциального антиглаукомного препарата, его влияние на биомеханические свойства роговицы, глубину передней камеры глаза оправданным будет измерение уровня ВГД методом прямой канюлизации [32].
Неинвазивные методы. В экспериментах на животных для измерения ВГД чаще используют неинвазивные тонометры, такие как аппланационный тонометр Гольдмана [33] и его переносные варианты [33–35], пневмотонометр [36] и другие ручные портативные тонометры.
Тонометр отскока или рикошета — единственный тонометр, специально разработанный для использования на грызунах (крысах, мышах). Позволяет измерять ВГД с помощью легкого металлического зонда, который прижимается к поверхности роговицы. Измерение ВГД у лабораторных животных, как правило, проводят с помощью отскоковой тонометрии, поскольку она неинвазивна, датчик контактирует с глазом только в течение очень короткого периода времени, ударяет с минимальной силой, тонометрию отскока можно проводить без анестезии роговицы и повторять неограниченное количество раз [31][29].
У большинства видов лабораторных животных, описываемых в данной статье, величина нормального ВГД составляет 15–25 мм рт. ст., а асимметрия его уровня между парными глазами может достигать 8 мм рт. ст. [37]. Однако эти данные несколько отличаются у разных авторов, например ВГД у крыс 17,30±5,25 мм рт. ст. [38], у кроликов 18,1±0,6 мм рт. ст. [39].
Тонометрия у находящихся в сознании животных при первоначальном воздействии с большой вероятностью вызовет страх и стрессовую реакцию, которые могут быть устранены только в результате нескольких тренировочных занятий. Оценка ВГД должна выполняться каждый раз в одно и том же время, так как ВГД колеблется в течение 24-часового цикла [31]. Скорость циркуляции внутриглазной жидкости непосредственно влияет на фармакокинетические параметры изучаемого соединения, ее необходимо учитывать при оценке суточных колебаний ВГД [18].
Офтальмологическая визуализация
Для изучения токсического действия соединений на структуры переднего отрезка глаза широко применяется биомикроскопия с помощью щелевой лампы. Для исследования у лабораторных животных удобнее применять портативные переносные модели, однако настольные биомикроскопы, как правило, имеют оптику лучшего качества, бóльшую вариативность ширины и ориентации щелевого луча. При интерпретации результатов биомикроскопии следует учитывать биологические особенности вида животного [37]. Например, у крыс линии Спрэг-Доули распространены фоновые патологии роговицы (рубцы, дистрофии, дегенерации), поэтому нивелирование их влияния на результаты исследования достигается путем рандомизации, чтобы особи с помутнениями роговицы были представлены во всех опытных группах. У таких видов, как кошки, собаки, кролики и грызуны, отсутствует боуменова мембрана, что влияет на проницаемость роговицы и концентрацию инстиллируемого соединения в передней камере глаза [18].
Обзор особенностей оценки результатов биомикроскопии с использованием щелевой лампы и их применимости в контексте современной офтальмологической токсикологии и разработки лекарственных средств, проведенный J.S. Eaton и соавт. [40], позволил выявить 138 оригинальных или модифицированных классификаций изменений структур переднего отрезка глаза. Авторы отметили, что для видов с пигментированными типом строения глаз, а также для собак, кошек, свиней, приматов системы оценки были недостаточно представлены в литературе (например, для последних отсутствует классификация хрусталиковых изменений). Присутствие меланина в радужке, цилиарном теле и сосудистой оболочке (внутриглазное депо для некоторых препаратов [41]) оказывает существенное влияние на фармакокинетику и фармакодинамику соединений. Поэтому авторы рекомендовали на доклиническом этапе оценки безопасности потенциальных лекарственных препаратов использовать хотя бы один вид лабораторных животных с пигментированными структурами глаза [40]. Для изучения токсических эффектов лекарственных средств, вводимых интравитреально, на сетчатку и зрительный нерв обоснованно выбирать такие виды лабораторных животных, которые имеют схожий с человеком объем стекловидного тела (4 мл), например кроликов [18].
Для осмотра глазного дна применяют прямую и обратную (непрямую) офтальмоскопию — технически простой, но весьма информативный метод исследования. Прямая офтальмоскопия и появившиеся позже бинокулярный непрямой офтальмоскоп, щелевая лампа и различные высокодиоптрийные асферические линзы позволяют получать изображения глазного дна in vivo [42], быстро оценивать состояние прозрачности глазных сред (развитие помутнений роговицы или хрусталика, гемофтальма), провести прямой осмотр артериовенозной системы, диска зрительного нерва, высокоспециализированной нервной ткани — сетчатки. Преимуществом прямой офтальмоскопии является возможность изучения глазного дна с сильным увеличением, чего нельзя добиться методом непрямого освещения.
Непрямая офтальмоскопия с помощью щелевой лампы позволяет визуализировать бóльшую поверхность сетчатки, включая крайнюю периферию [43]. Расширение функциональных возможностей щелевой лампы достигается посредством использования при работе с ней специальных офтальмологических линз различных типов. Использование асферических поверхностей в офтальмологических линзах, применение высокоэффективных просветляющих покрытий, внедрение в медицинскую практику лазерных микрохирургических установок, появление новых материалов привело к тому, что в настоящее время на мировом рынке офтальмологической аппаратуры представлена широчайшая гамма контактных и бесконтактных линз.
У животных разных биологических видов имеются различия в анатомии глазного дна, что следует учитывать при проведении офтальмоскопии и оценке ее результатов. Большинство лабораторных животных, за исключением приматов, не имеют макулы и фовеи [18]. Кошки и собаки имеют tapetum lucidum — светоотражающий слой для синего, зеленого и желтого цветов. У кроликов, которые благодаря сходным размерам глазного яблока довольно часто используются в экспериментах, сетчатка имеет значимые отличия от сетчатки человека (мерангиотический тип сетчатки, отсутствие макулярной области, иное распределение фоторецепторов различных типов, выраженная миелинизация нервных волокон в горизонтальной плоскости).
Существующие системы оценки состояния глаз с применением щелевой лампы (тест Дрейза, классификации Макдональда–Шеддака, Хакетта–Макдональда, оценка проявлений увеита (standardization of uveitis nomenclature, SUN) и др.) рассчитаны на кроликов-альбиносов, поэтому J.S. Eaton и соавт. [40] разработали собственную систему полуколичественной доклинической оценки офтальмотоксичности SPOTS (semiquantitative preclinical ocular toxicology scoring system). Авторы включили в данную систему расширенные критерии оценки состояния переднего и заднего отрезков глаза, стандартизированные настройки щелевой лампы, применимость у всего спектра видов лабораторных животных [44].
Наряду со щелевыми лампами для исследования и фотографирования различных участков глаза широко используются фундус-камеры. Фундус-камера дает возможность проводить мультиспектральную съемку и анализ изображения, флуоресцентную ангиографию и сравнительную оценку полученных данных в динамике (мониторинг), а также архивировать полученные данные [45][46].
Растущая доступность смартфонов и повышение качества встроенных в них цифровых камер в последнее десятилетие сделали возможной (и легкой) запись четких, детализированных фотографических изображений глазного дна. Офтальмоскопия с помощью смартфона стала реальной альтернативой традиционным подходам к визуализации глазного дна, особенно в местах с ограниченными ресурсами [42].
Е.В. Прудникова и соавт. [23] рекомендуют проведение офтальмоскопии дважды: до начала исследования и перед его завершением, однако кратность исследования должна быть увеличена в экспериментах с длительностью более 3 месяцев и в случае, когда высоко ожидаем офтальмотоксический эффект разрабатываемого лекарственного препарата. Авторы также указывают на целесообразность промежуточных исследований в критических точках эксперимента и/или при появлении у лабораторных животных признаков глазной патологии.
Использование ОКТ позволяет прижизненно получать подробную гистоморфометрическую картину ретинальной патологии, выполняется при токсикологических исследованиях на различных видах лабораторных животных как при интраретинальной инъекции, так и при системном введении изучаемого соединения [47]. Так, с помощью ОКТ была показана дегенерация фоторецепторов (истончение наружного ядерного слоя сетчатки) при интравитреальном, внутривенном и внутрибрюшинном введении мышам йодоуксусной кислоты [48].
Офтальмологическая визуализация играет важную роль при исследовании как офтальмологических препаратов, так и препаратов, применяемых при системных заболеваниях с офтальмологическими проявлениями [49].
Исследование микроциркуляции глаза
Количественная оценка глазного кровотока, особенно измерение общего кровотока в сетчатке, важны для диагностики и лечения различных типов глазных заболеваний [50][51] и могут использоваться для оценки влияния медикаментозных препаратов на глазной кровоток. Одним из наиболее распространенных методов для оценки микроциркуляции у экспериментальных животных является флюоресцентная ангиография (ФАГ), которая нашла широкое применение в офтальмологии. Например, с помощью сочетания ОКТ и ФАГ было продемонстрировано развитие субретинального отека после интравитреального введения DL-альфа-аминоадипиновой кислоты у новозеландских белых кроликов и мышей [52]. Авторы предложили использовать данную модель субретинального отека при доклиническом исследовании лекарственных средств.
OКT-ангиография (ОКТА) визуализирует медленный поперечный поток в капиллярах, что позволяет обнаружить вариацию или декорреляцию сигнала OКT между изображениями поперечного сечения. Поскольку используется внутренний контраст движущихся клеток крови, введение красителя не требуется. ОКТ-ангиография является трехмерной, поэтому сетчаточные и хориоидальные сосудистые сплетения могут быть разделены на блоки для визуализации анфас и количественной оценки [53]. C помощью комбинации методов ЭРГ, ОКТ, ОКТА была доказана меньшая ретинотоксичность у кроликов ингибитора гистонодеацетилазы белиностата как перспективного средства для интравитреальной химиотерапии внутриглазной ретинобластомы, по сравнению с мелфаланом [52].
Лазерная допплеровская флоуметрия обеспечивает непрерывное измерение тканевой перфузии в относительно маленьком объеме материала [54]. Это неинвазивный метод, который можно использовать в эксперименте для выполнения повторных измерений в течение коротких или длительных периодов времени [55]. Так, использование лазерной допплеровской флоуметрии позволило выявить снижение уровня хориоидального кровотока после интравитреального введения ингибитора ангиогенеза ранибизумаба, подтверждая наличие вазоконстрикторного эффекта препарата [56].
Электрофизиологические методы диагностики
Электрофизиологическое исследование является одним из наиболее информативных методов диагностики заболеваний структур сетчатки, важным источником объективной оценки функционального состояния зрительного анализатора [57]. Изменение биоэлектрической активности сетчатки, как правило, предшествует выявлению выраженных органических поражений тканей глаза, в том числе в результате действия лекарственных средств.
ЭРГ, высокочувствительный метод считывания потенциала фоторецепторов сетчатки в ответ на световое раздражение, является наиболее применимым для исследований на животных. Мишенями лекарственных препаратов являются рецепторы, эндогенные сигнальные молекулы или потенциалзависимые ионные каналы, которые могут влиять на электрические свойства нейронов. ЭРГ позволяет in vivo отслеживать эффекты лекарственных средств на зрительные пути в условиях, приближенных к естественным [58]. Проведение ЭРГ лабораторным животным возможно как согласно руководству Международного общества клинической электрофизиологии зрения (International Society for Clinical Electrophysiology of Vision, ISCEV) по процедурам визуальной электродиагностики [59], так и по адаптированным тестам для отдельного биологического вида [14]. При изучении фармакологического и токсического эффектов (депрессия амплитуды ЭРГ-волн) потенциального лекарственного средства преимуществом ЭРГ является то, что она позволяет оценить эти эффекты количественно [57].
Для проведения исследования животным инстиллируют мидриатик и анестетик в оба глаза. ЭРГ регистрируется с поверхности роговицы с помощью электродов. У лабораторных животных регистрация обычно проводится под наркозом, хотя также были опубликованы данные о возможности проведения этой процедуры без наркоза [60][61]. Активный электрод накладывают на роговицу, референсный игольчатый электрод вводят подкожно в затылочную часть головы, игольчатый электрод заземления вводят подкожно сбоку в область нижнего ребра или хвоста.
ЭРГ можно проводить после темновой и световой адаптации. Адаптированное к темноте состояние используется, когда исследователь заинтересован в палочко-опосредованном ответе. Световая адаптация эффективно насыщает палочки, и, таким образом, светоадаптацию можно использовать для извлечения реакций, вызываемых колбочками. ЭРГ основана на изменении ионного тока в сетчатке при вспышке света. В исследованиях ЭРГ у мышей и крыс в качестве стимулирующих устройств используют стробоскопические вспышки [62] или эффект Ганцфельда [63–65]. А.А. Суетов и соавт. [66] описали проведение мультифокальной ЭРГ у кроликов с помощью прибора «Нейро-ЭРГ» («Нейрософт», Россия), где в качестве светового стимулятора использовали LCD-монитор.
Токи, образующиеся в радиально ориентированных клетках сетчатки (фоторецепторах, биполярных клетках, клетках Мюллеровой глии и клетках пигментного эпителия сетчатки), преимущественно текут в одном направлении и генерируют суммарный потенциал, легко регистрируемый дистальным роговичным электродом. Мгновенная электроретинограмма может быть получена с использованием различных параметров стимуляции и фонового освещения, а также могут быть проанализированы многочисленные отдельные компоненты ЭРГ, каждый из которых указывает на функциональность различных классов клеток сетчатки.
С помощью ЭРГ анализируют амплитуды и задержки а- и b-волн. А-волна в основном обусловлена активацией фоторецепторов, тогда как b-волна в основном генерируется активацией глутаматергических биполярных клеток ON-типа. Латерально ориентированные клетки сетчатки вносят незначительный вклад в обычную вспышку ЭРГ, вместо этого они формируют ответ паттерн-ЭРГ, специального метода, используемого для записи внутренних ответов сетчатки [67].
ЭРГ позволяет количественно оценить степень токсического поражения сетчатки (амплитуда и латентность а- и b-волн), локализовать макулярные нарушения (при мультифокальной ЭРГ), определить преимущественное нарушение функций нейронов сетчатки. Например, паттерн-ЭРГ характеризует состояние ганглиозных клеток сетчатки, ритмическая ЭРГ с частотой 30 Гц — состояние колбочек, полнопольная (Ганцфельд) ЭРГ после темновой адаптации показывает комбинированный (максимальный) ответ фоторецепторов, однако у грызунов с преобладанием палочкового аппарата требуется более длительная темновая адаптация [63][68].
Существует ряд моделей заболеваний сетчатки и зрительного нерва (например, глаукомное поражение слоя нервных волокон (глаукомная нейропатия), диабетическая ретинопатия, другие ишемические поражения сетчатки), влияние которых на зрительные электрофизиологические параметры достаточно хорошо изучено, что позволяет использовать их при исследовании лекарственных средств. ЭРГ может обеспечить раннее указание на функциональное восстановление в ответ на терапевтическое вмешательство [58].
Преимуществами ЭРГ являются возможность использования у всех основных видов лабораторных животных и быстрота проведения при определенном опыте и квалификации исполнителя. Изменения биоэлектрической активности сетчатки под влиянием того или иного патологического фактора наступают раньше, чем развиваются морфологические нарушения в сетчатке и зрительном нерве. Таким образом, результаты ЭРГ могут продемонстрировать самые ранние ретинотоксические функциональные эффекты изучаемого соединения, когда офтальмоскопия будет малоинформативна [63]. В литературе описано применение ЭРГ для выявления офтальмотоксического действия соединений как при системном (внутривенном, внутрибрюшинном, пероральном), так и при локальном введении (интравитреальном, субконъюнктивальном, инстилляции в конъюнктивальную полость) [64][69][70].