Изучение профиля безопасности оригинального препарата на основе секретома мезенхимных стромальных клеток при интратестикулярном введении кроликам

ВВЕДЕНИЕ

Проблема бесплодия затрагивает от 8 до 17% пар во всем мире, причем мужской фактор по разным данным вносит значимый вклад примерно у 30–50% пар. По данным различных исследований, в большинстве случаев мужское бесплодие определяется как идиопатическое [1–5]. В связи с невозможностью точного установления этиологии в этом случае терапевтические подходы включают вспомогательные репродуктивные технологии или эмпирическое лечение, включающее гормональную терапию, селективные модуляторы рецепторов эстрогена, ингибиторы ароматазы или антиоксиданты. Некоторые препараты, такие как бромкриптин, альфа-блокаторы, системные кортикостероиды, магний, гонадотропин, фолликулостимулирующий гормон, назначают не по показаниям, утвержденным в инструкции по медицинскому применению (off-label) для лечения идиопатического мужского бесплодия. По данным Европейской ассоциации урологов (European Association of Urology), перечисленные подходы зачастую не имеют достаточной доказательной базы, часть из них обладает низкой эффективностью или небезопасна для пациентов [6–8]. Таким образом, для результативной терапии мужского бесплодия необходим поиск новых терапевтических подходов.

Патогенез мужского бесплодия может включать повреждение сразу нескольких клеточных типов, формирующих специфическое микроокружение сперматогониальной стволовой клетки, или нишу, которая поддерживает ее функционирование для обеспечения сперматогенеза. В связи с этим перспективной стратегией может быть плейотропное воздействие сразу на несколько поврежденных компонентов ниши. Ранее такая фармакологическая активность нами была показана для мезенхимных стромальных клеток (МСК). МСК оказывают регенеративное действие преимущественно за счет секреции комбинации паракринных компонентов — секретома, который включает факторы роста, цитокины, хемокины, молекулы в составе внеклеточных везикул и белки внеклеточного матрикса [9]. Преимуществом МСК является низкая иммуногенность за счет секреции иммуномодулирующих факторов, а использование только секретома позволяет избежать иммунного ответа на клеточные компоненты. Важно отметить, что использование бесклеточного препарата (секретома МСК) снижает риски, связанные с возможным ответом иммунной системы экспериментальных животных (в данной работе — кроликов) на антигены клеток человека в доклинических исследованиях [10]. Введение секретома МСК под белочную оболочку семенников способствовало восстановлению сперматогенеза у крыс в модели крипторхизма и у мышей в модели химиотерапевтического повреждения сперматогенеза доксорубицином [11][12].

В соответствии с регуляторными требованиями¹ препарат на основе секретома МСК относится к биологическим лекарственным препаратам, поскольку производится с использованием клеток жировой ткани человека. В предыдущей работе нами была показана безопасность препарата на основе секретома МСК в исследованиях общей, субхронической, иммунологической и репродуктивной токсичности на грызунах [13]. Изучение безопасности на двух видах животных, грызунах и негрызунах, является необходимым этапом доклинических исследований оригинального лекарственного препарата². В данной работе представлены результаты оценки безопасности данного препарата на кроликах как на животных, не относящихся к грызунам.

Цель работы — изучение общетоксического действия, фармакологической безопасности, пирогенности, иммунотоксических свойств и местной переносимости оригинального биологического препарата на основе секретома МСК при двукратном введении под белочную оболочку семенников половозрелым кроликам.

Задачи исследования оригинального биологического препарата на основе секретома МСК следующие.

1. Изучить общетоксическое действие.
2. Изучить фармакологическую безопасность.
3. Выявить потенциальный орган-мишень токсического воздействия.
4. Изучить пирогенность.
5. Изучить токсичность в отношении компонентов иммунной системы.
6. Изучить токсичность в отношении репродуктивной системы.
7. Изучить местную переносимость.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные. В исследовании использовали 50 половозрелых самцов кроликов породы Советская шиншилла (5 групп по 10 животных) с массой тела 3493±380,8 г на начало эксперимента (питомник ФГУП ОПХ «Манихино»). Проведение исследований было одобрено на заседании биоэтической комиссии (БЭК) АО «НПО «ДОМ ФАРМАЦИИ» (протокол заседания БЭК от 27.09.2023 № 1.41/23). Животных содержали в стандартных условиях в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского Союза от 22.09.2010³ и Руководством по содержанию и использованию лабораторных животных⁴.

Животных содержали в стандартных условиях по одному кролику в клетке. Кролики получали стандартный корм и воду очищенную ad libitum. Исследуемый препарат и плацебо вводили предварительно наркотизированным животным. Наркотизацию животных выполняли путем внутривенного введения ветеринарных препаратов Золетил 100 (Virbac, Франция) и Ксила (Interchemie, Нидерланды) в дозах 25 и 5 мг/кг соответственно.

Исследуемый препарат. Биологический лекарственный препарат МедиРег на основе секретома МСК был наработан в составе серии PR120306 на Научно-производственном участке Центра регенеративной медицины Медицинского научно-образовательного института МГУ имени М.В. Ломоносова (лицензия на производство лекарственных средств для медицинского применения № Л012-00102-77/00764252) в соответствии с промышленным регламентом № 001-2023.

Выделение МСК из жировой ткани человека. Образцы жировой ткани здоровых доноров механически измельчали, смешивали с растворами ферментов коллагеназы I типа (200 ед/ мл, Worthington Biochemical, США) и диспазы (40 ед/ мл, Sigma, Германия) и инкубировали при температуре 37 °C в течение 30–45 мин. Затем ферменты ингибировали добавлением равного объема среды, смесь центрифугировали при 200 g в течение 10 мин. Осадок суспендировали, а затем фильтровали через нейлоновые фильтры с размером пор 100 мкм BD Falcon Cell Strainer (BD, США) и центрифугировали при 200 g 5 мин. Осадок ресуспендировали в культуральной среде AdvanceSTEM™ (HyClone, США), после чего выделенные клетки высаживали в культуральные флаконы. Работу с материалом доноров проводили после получения информированного согласия в соответствии с разрешением локального этического комитета (ЛЭК) Университетской клиники МНОИ МГУ имени М.В. Ломоносова, IRB00010587 (протокол заседания ЛЭК от 13.11.2023 № 10/23).

Получение секретома МСК. Для получения секретома МСК клетки 5–6 пассажа, достигшие 80% конфлюентности, промывали трехкратно раствором Хэнкса (ООО НПП «ПанЭко», Россия). Во флаконы добавляли среду DMEM с низким содержанием глюкозы (Gibco, США). Клетки культивировали в течение 7 сут, после чего собирали кондиционированную среду, очищали от клеточного дебриса путем центрифугирования в течение 10 мин при 300 g, а затем 30 мин при 2000 g при температуре 4 °С.

Концентрирование секретома МСК. Для концентрирования использовали фильтры для центрифуги JetSpin (FTT510500, Jet Bio-Filtration, Китай) с размером пор, предназначенным для отсечения молекул размером меньше 10 кДа. Секретом МСК концентрировали на фильтрах при скорости 3000 g. Полученный концентрат дозировали по 1 мл во флаконы и лиофилизировали.

Выбор дозы и способа введения. Выбор дозы и кратности применения проведен на основании руководства⁵: терапевтическая доза и две дозы, превышающие терапевтическую, в режиме дозирования на одно введение больше, чем предполагается в клинической практике. В клинической практике предполагается однократное введение препарата, количество инъекций в данном исследовании равнялось двум. Летальную дозу в предыдущем исследовании [13] установить не удалось, поэтому помимо терапевтической дозы были изучены максимально переносимые дозы — в 1,5 и 2,5 раза превышающие терапевтическую.

Для определения дозозависимости токсических эффектов выбраны следующие дозы: терапевтическая доза (1 доза с содержанием эндотелиального фактора роста сосудов (vascular endothelial growth factor, VEGF) не менее 0,76 нг), доза, превышающая терапевтическую дозу в 1,5 раза (1,5 дозы с содержанием VEGF не менее 1,14 нг) и в 2,5 раза (2,5 дозы с содержанием VEGF не менее 1,9 нг).

Перед введением животным лиофилизат секретома МСК разводили водой для инъекций в количестве, необходимом для получения дозы, затем смешивали с коллагеновым гелем Аппликолл (ООО «МакМеди», Россия) в объемном соотношении 1:4. Полученный раствор вводили в оба семенника в объеме, максимально возможном для данного вида животного: по 190 мкл в каждый. В качестве плацебо использовали смесь растворителя воды для инъекций и носителя коллагенового геля Аппликолл в соотношении 1:4. Плацебо вводили животным в объеме, эквивалентном максимальному объему введения тестируемого препарата.

Дизайн исследования. Всего в исследование было включено 5 групп животных по 10 особей⁶: группы 1 и 2 — контрольные, группы 3–5 — получавшие исследуемый препарат. В качестве контроля были взяты интактные животные и животные, которым вводили плацебо в объеме, аналогичном объему введения исследуемого биологического лекарственного препарата. Плацебо или препарат на основе секретома МСК вводили на 1 и 28 сут.

За экспериментальными животными проводили наблюдение в течение всего периода введения препарата (всего 30 сут), а также отсроченно — 30 сут после окончания инъекций для определения обратимости возможных патологических изменений. Дизайн исследования представлен в таблицах 1, 2.

Общеклиническое наблюдение. У животных регистрировали: поведение, положение тела в пространстве, состояние шерстяного покрова, дефекацию и изменения в месте введения. Более детальный осмотр не выполняли, так как не отмечали выраженных признаков интоксикации, которые свидетельствовали бы об отклонении от нормы состояния животных.

Анализ мочи. Для сбора мочи животных на 4 и 24 ч помещали в индивидуальные метаболические клетки со стеклянным гранулятом. После сбора образцы мочи переносили в центрифужные пробирки и центрифугировали в течение 10 мин при 1500 об/мин. Аликвоты надосадочной жидкости отбирали в 96-луночные планшеты для проведения качественных реакций на патологические компоненты мочи. Общий анализ мочи был проведен по следующим параметрам: эритроциты, общий белок, глюкоза, билирубин, относительная плотность, pH. Для определения рН мочи использовали тест-полоски (DF, Китай). Относительную плотность мочи определяли с помощью рефрактометра AMTAST VUR3T (AMTAST, США). Микроскопическое исследование мочевого осадка не проводили, так как в пробах не было выявлено положительной реакции на кровь. Пробы мочи, собранные через 24 ч, использовали для определения суточного диуреза. В объединенной пробе с помощью биохимического анализатора Random Access A-25 (Biosystem, Испания) определяли креатинин (с расчетом клиренса креатинина) и мочевину.

Оценка гематологических показателей. Кровь забирали прижизненно из краевой вены уха в объеме 0,2 мл в пробирки Impromini с трикалиевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА K3) (IMPROVE, Китай). В цельной крови с антикоагулянтом на гематологическом анализаторе Mythic 18 (Orphee, Швейцария) определяли следующие показатели: количество эритроцитов, 10¹²/л; уровень гемоглобина, г/л; гематокрит, %; количество лейкоцитов, 10⁹/л; количество тромбоцитов, 10⁹/л; лимфоциты, %; моноциты, %; гранулоциты, %. Дополнительные параметры не проанализированы в связи с отсутствием клинически значимых отклонений основных показателей у животных в группах, получавших исследуемый препарат, от животных интактной группы.

Определение параметров гемостаза. Кровь забирали прижизненно из краевой ушной вены в объеме 0,7 мл в пробирки с 3,8% цитратом натрия. Далее пробы крови центрифугировали с помощью центрифуги Z216МК (Hermle Labortechnik, Германия) 15 мин при 1800 g (4350 об/мин) для получения плазмы. В образцах цитратной плазмы определяли протромбиновое время, активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) и фибриноген с помощью коагулометра АПГ4-02-П (ООО «ЭМКО», Россия).

Оценка биохимических показателей крови. Кровь отбирали из краевой ушной вены в пробирки Improvacuter с активатором свертывания (IMPROVE, Китай). Для получения сыворотки кровь центрифугировали на центрифуге лабораторной клинической ОПн-3.04 «Дастан» (ОАО «ТНК «Дастан», Кыргызская Республика) 15 мин при 3000 об/мин. Полученную сыворотку переносили во вторичные пробирки. Биохимические показатели крови: аланиновая трансаминаза, аспарагиновая трансаминаза, общий белок, альбумин, креатинин, мочевина, общий билирубин, общий холестерин, триглицериды, щелочная фосфатаза, глюкоза, лактатдегидрогеназа — определяли в сыворотке крови на биохимическом анализаторе Random Access А-25 (Biosystems, Испания) с использованием реагентов фирмы BioSystems (Испания).

Оценка миелограммы. Взятие и анализ (микроскопия мазка) костного мозга не проводили в соответствии с планом исследования, поскольку в клиническом анализе крови животных, получавших исследуемые объекты, не было зарегистрировано отклонений в гематологических показателях.

Оценка фармакологической безопасности.

Влияние на сердечно-сосудистую систему. Для регистрации электрокардиограммы (ЭКГ) животное предварительно наркотизировали. Регистрацию ЭКГ проводили с помощью компьютерного электрокардиографа для ветеринарии «Поли-спектр-8/Е» (ООО «Нейрософт», Россия) не менее 60 с. Для неинвазивного метода использовали электроды многоразовые прижимные. Проводили сравнительную оценку следующих показателей: частота сердечных сокращений, RR (мс), P (мс), PQ (мс), QRS (мс), QT (мс). После регистрации ЭКГ у животных измеряли систолическое артериальное давление неинвазивным методом при помощи ветеринарного монитора давления Zoomed BPM-2 (Zoomed, Россия).

Влияние на дыхательную систему. Оценку частоты дыхательных движений проводили визуально за 1 мин у предварительно наркотизированных животных.

На 30 и 59 сут эксперимента были отобраны образцы артериальной крови для определения газового состава крови. Кровь отбирали из центральной ушной артерии при помощи катетера 26G в шприцы в объеме 50–100 мкл и при помощи газоанализатора i-STAT (Abbott, США) определяли следующие параметры: парциальное давление углекислого газа, парциальное давление кислорода, насыщение гемоглобина кислородом.

Оценка функционального состояния центральной нервной системы. Проводили с помощью батареи тестов, предложенной S. Irwin, с модификациями и рекомендованной для оценки фармакологической безопасности руководством S7A IСH⁷ [14][15]. Для оценки возможных поведенческих и/или физиологических изменений регистрировали наличие или отсутствие патологических признаков, указывающих на возбуждение или седацию, стереотипные движения, изменения в локомоторной активности, оценку рефлексов, оценку состояния вегетативной нервной системы и дыхания.

Оценка нефротоксичности. Изучение нефротоксичности включало оценку суточного диуреза; показателей общего анализа мочи: относительная плотность, pH, глюкоза, билирубин, белок, кровь, кетоны; показателей биохимического анализа мочи: креатинин и мочевина; клиренс креатинина; оценку массовых коэффициентов и гистологический анализ почек.

Оценка пирогенности. Температуру тела регистрировали на 1 и 28 сут (до введения и через 3 ч после введения исследуемого препарата или плацебо) с помощью ректального термометра (ректального датчика) ветеринарного монитора пациента Zoomed IM-10 (ЗАО «Ист Медикал», Россия). Испытание проводили на кроликах с исходной температурой 38,8–39,1 ºС, статистически значимо не различавшейся между группами. В рамках данного эксперимента исследуемый объект признают апирогенным, если полученный результат ≤1,2 ºС, а индивидуальное повышение температуры ни у одного из 5 кроликов в группе не превышает 0,5 ºС⁸.

Изучение иммунотоксических свойств. Изучали гематологические и биохимические показатели крови (общее количество лейкоцитов, абсолютные дифференциальные показатели лейкоцитов, уровень глобулинов), гистологическое исследование органов (тимус, селезенка, паховые лимфатические узлы, костный мозг), оценивали массовые коэффициенты органов (тимус, селезенка)⁹.

Эвтаназия. Животных эвтаназировали при помощи наркотизации с последующим удалением жизненно важных внутренних органов (конечный этап эвтаназии)¹⁰. Данный вид эвтаназии животных сопровождался минимумом боли, страдания и дистресса и проводился компетентными сотрудниками.

Патоморфологическое исследование. После эвтаназии животные были тщательно обследованы на предмет внешних патологических признаков. Органы, извлеченные при некропсии, были взвешены, парные органы взвешивали вместе. Данный показатель использован для расчета процентного отношения массы органов к массе тела по формуле (1):

, (1)

где m_o — масса органа, m_m — масса тела животного.

Процедуру взвешивания внутренних органов осуществляли на электронных весах ВК-300 (ЗАО «Масса-К», Россия). Наименьший предел взвешивания 0,1 г, наибольший — 300 г. Цена поверочного деления 0,01 г, класс точности II.

У животных были взяты следующие органы (фрагменты органов) и ткани: аорта, сердце, трахея, легкие с бронхами, тимус, слюнные железы, пищевод, желудок, двенадцатиперстная кишка, подвздошная кишка, слепая кишка, толстый кишечник, поджелудочная железа, печень, селезенка, почки, мочевой пузырь, желчный пузырь, надпочечники, семенники, придаток левого семенника (эпидидимис), простата, семенные пузырьки, паховые лимфатические узлы, щитовидная и паращитовидная железы, головной мозг, спинной мозг, гипофиз, седалищный нерв, глазные яблоки, гардерова железа, кожа, кость с костным мозгом (бедренная кость с сохранением эпифиза), скелетные мышцы, органы с макроскопическими изменениями, обнаруженными при некропсии. Органы, подлежащие взвешиванию: головной мозг; сердце; легкие с трахеей, тимус, печень, селезенка, почки, надпочечники, семенники.

Для последующего гистологического исследования органы и ткани были зафиксированы в 10% растворе нейтрального формалина в течение 24 ч [16]. После фиксации была проведена гистологическая проводка — дегидратация материала при помощи автоматического гистопроцессора KD-TS3S1 (Китай) в изопропиловых спиртах восходящей концентрации с последующей инфильтрацией парафином при температуре 55–57 °С. Полученные фрагменты заливали в парафиновые блоки, из которых изготавливали срезы толщиной 3–5 мкм. Срезы депарафинизировали в растворе ксилола, окрашивали гематоксилином и эозином при помощи автоматической станции для окраски гистологических препаратов KD-RS (Китай) и после просветления заключали под покровное стекло [17]. Анализ гистологических препаратов проводили при помощи светооптического микроскопа Микромед 2 (3–20 inf.) (ООО «Наблюдательные приборы», Россия) при увеличении в 40, 100 и 400 раз. Микрофотографирование проводили при помощи цифровой фотокамеры ToupCam UCMOS05100KPA (Китай) и программного обеспечения ToupView 3.7.7892.

Оценка местной переносимости. Для оценки местной переносимости при некропсии визуально оценивали макроскопические изменения в тканях семенника, а также проводили гистологическую оценку тканей, непосредственно контактировавших с исследуемыми объектами.

Анализ данных. Для всех данных была применена описательная статистика: данные проверяли на соответствие закону нормального распределения с помощью критерия Шапиро–Уилка. В случае нормального распределения рассчитывали среднее значение (M) и стандартное отклонение (SD), которые вместе со значением n (количество наблюдений) представлены в итоговых таблицах. В случаях несоответствия данных закону нормального распределения рассчитывали медиану (Me) и квартильный размах (Q1;Q3). Оценку наличия выбросов в данных не проводили.

Для оценки независимых данных с признаками нормального распределения использовали однофакторный дисперсионный анализ (one-way ANOVA). Независимые данные были проверены на гомогенность дисперсий с помощью критерия Брауна–Форсайта. Для оценки связанных данных использовали дисперсионный анализ c повторными измерениями (repeated measures ANOVA), данные предварительно проверяли на сферичность дисперсий с помощью теста Моучли. В случае невыполнения предположения о сферичности дисперсий применяли дисперсионный анализ с эпсилон-корректировкой методом Гейссера–Гринхауса. В случае обнаружения достоверного влияния исследуемого фактора последующие межгрупповые сравнения (post-hoc analysis) проводили с использованием критерия Тьюки.

Для анализа независимых данных, не подчиняющихся закону нормального распределения или не соответствующих критериям применения дисперсионного анализа, использовали критерий Краскела–Уоллиса с дальнейшим применением метода средних рангов для множественных сравнений в случае обнаружения достоверного влияния исследуемого фактора. Различия определяли при уровне значимости р≤0,05. Статистический анализ данных выполняли с помощью лицензированного программного обеспечения Statistica 10.0 (StatSoft, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Общетоксическое действие

Случаев гибели и интоксикации животных во всех группах в эксперименте не зарегистрировано. Кролики были в удовлетворительном состоянии, поведенческие реакции и динамика массы тела кроликов, получавших тестируемый препарат, не отличались от показателей интактных и получавших плацебо животных, в том числе в период отсроченного наблюдения.

Общий и биохимический анализы мочи. По окончании периода введения под белочную оболочку семенника в группе животных, получавших плацебо, отмечали повышение уровня креатинина и мочевины в моче относительно интактной группы. Однако по окончании периода отсроченного наблюдения клинически значимых эффектов не наблюдали, что указывает на обратимость выявленного эффекта. Креатинин и мочевина являются почечными факторами, повышение их уровня может указывать на снижение почечной функции или повышенное разрушение мышечных клеток. Уровень креатинина и мочевины может изменяться под влиянием препаратов, при обезвоживании и выполнении различных манипуляций на животных в результате индивидуальных реакций [18]. Для выявления точной причины повышения креатинина и мочевины в моче может потребоваться более тщательное диагностическое обследование.

Гематологические, биохимические показатели крови и параметры системы гемостаза. На 3 сут после введения препарата на основе секретома МСК в количестве 1,5 и 2,5 терапевтической дозы у животных было обнаружено снижение протромбинового времени относительно интактной группы, которое выходило за пределы референсного интервала 8,7–11,0 с, но не дублировало динамику значений, полученных на 31 сут эксперимента, где не наблюдали статистически значимых значений между группами (рис. 1). По окончании периода отсроченного наблюдения снижение протромбинового времени ниже референсного интервала отмечали только в группе плацебо, что, по-видимому, является феноменом, не связанным с введением исследуемого препарата и плацебо.

Клинически значимого влияния исследуемого препарата и плацебо на остальные гематологические и биохимические показатели не выявлено.

Фармакологическая безопасность. Не выявлено токсичности препарата на основе секретома МСК и коллагенового геля в отношении сердечно-сосудистой, дыхательной систем и почек. При введении исследуемого препарата (2,5 терапевтической дозы с содержанием VEGF не менее 1,9 нг) не выявлена токсичность в отношении центральной нервной системы. Поскольку не было отклонений при введении максимальной дозы препарата, тест Ирвина у животных, получавших среднюю и минимальную дозу препарата, не проводили.

Результаты патоморфологического исследования. У единичных особей во всех группах по окончании периода введения наблюдали небольшие свежие кровоизлияния в легких (рис. 2А, 2B), эрозивно-язвенные поражения слизистой оболочки желудка (рис. 2C). Данные изменения характеризуются как острый процесс и могут являться как следствием процедуры эвтаназии, так и фоновым спонтанным заболеванием. У всех остальных животных микроскопических изменений в исследованных органах и тканях не выявлено, а строение соответствовало норме.

Пирогенность

Выявлено статистически значимое отличие показателя температуры «до введения» и «через 3 ч после введения» в группах, получивших плацебо, 1 и 2,5 дозы тестируемого объекта. Однако выявленное отличие было меньше 1,2 ºС, а индивидуальное повышение температуры ни у одного из пяти кроликов не превышало 0,5 ºС, что указывает на апирогенность исследуемых объектов, вводимых в изучаемых дозах¹¹.

Иммунотоксические свойства

По окончании периода введения и периода отсроченного наблюдения клинически значимых отклонений по общему количеству лейкоцитов, абсолютному количеству лимфоцитов, моноцитов, гранулоцитов, уровню глобулинов не выявлено. Патологических отклонений в тканях паховых лимфатических узлов, тимуса, селезенки, костного мозга у животных всех групп не наблюдали, что говорит об отсутствии иммунотоксического эффекта у исследуемого препарата и коллагенового геля.

Репродуктивная токсичность и местная переносимость

Ранее в расширенных исследованиях репродуктивной токсичности на грызунах было показано отсутствие токсического воздействия на репродуктивную функцию крыс и потомства в первом и втором поколении [13]. У кроликов исследуемый препарат на основе секретома МСК и плацебо не оказали влияния на спермограмму экспериментальных животных. В месте введения в семенниках, прилегающих тканях и органах половой системы макроскопически видимых изменений не обнаружено. У всех кроликов семенники были в форме эллипса, плотной консистенции, окружены плотной соединительнотканной белочной оболочкой, хорошо просматривалась сосудистая сеть органа. Вместе с тем при проведении патоморфологического анализа по окончании периода введения у 2 из 5 самцов (40%) из группы плацебо выявлено увеличение в размерах пузырьковидных желез, дольки которых были резко расширены и содержали прозрачный секрет, предположительно коллаген, свободно вытекающий при разрезе (рис. 3, табл. 3).

Однако микроскопическое строение пузырьковидной железы у самцов из группы плацебо не было нарушено, дистрофические изменения эпителия отсутствовали, отмечено разглаживание обычно складчатой слизистой оболочки и уплощение эпителия в результате скопления секрета в полости (рис. 4).

Гистологический анализ семенников показал, что у большинства животных их строение соответствовало норме. Семенники покрыты белочной оболочкой, паренхима образована многочисленными извитыми канальцами, выстланными сперматогенным эпителием. Сперматогенез завершенный, представлен большим количеством сперматозоидов в просветах канальцев. В интерстиции обнаружено большое количество мелких сосудов и группы гландулоцитов, представленных клетками Лейдига (рис. 5А).

По окончании периода введения (табл. 3) у одного самца, получавшего 1,5 терапевтической дозы препарата на основе секретома МСК, и у одного самца из группы плацебо были выявлены участки значительного расслоения соединительнотканных перегородок с формированием полости, заполненной «рыхлым» веществом, предположительно коллагеном, с выраженным эозинофильным окрашиванием. При этом канальцы вдоль стенки полости деформированы в результате сдавливания, но без признаков дистрофических нарушений сперматогенного эпителия (рис. 5B, 5C). В период отсроченного наблюдения подобные изменения наблюдали в среднем у 1–2 животных из 5 в группе (20–40%) животных, получавших исследуемый препарат (все три группы) и плацебо. У интактных животных подобные изменения не выявлены.

Единичные гистологические изменения — участки расслоения соединительнотканных перегородок с формированием полости между семенными канальцами, вероятно, обусловлены механическим воздействием локального введения максимального объема исследуемого препарата и плацебо. Данный эффект сохранялся вплоть до 60 сут, что, по-видимому, свидетельствует о необходимости более длительного периода для биодеградации коллагена в тканях семенника. Однако следует отметить, что патологические изменения не вызывали развития дистрофических изменений в семенных канальцах и не затрагивали сперматогенез, что позволяет сделать вывод об отсутствии токсического влияния препарата на основе секретома МСК и носителя в составе препарата (коллагенового геля) на мужскую репродуктивную систему.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследуемый препарат на основе секретома МСК в изученных дозах и носитель в составе препарата (коллагеновый гель) не оказали негативного влияния на общее состояние животных, динамику массы тела, гематологические и биохимические показатели, состояние репродуктивной, сердечно-сосудистой, дыхательной и центральной нервной системы. Не было выявлено нефротоксичности, иммунотоксичности и пирогенности исследуемого препарата и носителя.

У животных из группы плацебо были выявлены обратимые гистологические изменения в пузырьковидной железе. В группах с введением препарата и с введением плацебо в семенниках выявлены участки значительного расслоения соединительнотканных перегородок с формированием полости, заполненной рыхлым веществом с выраженным эозинофильным окрашиванием, и деформация канальца вдоль стенки полости в результате сдавливания. Обнаруженные изменения, по-видимому, обусловлены механическим воздействием довольно большого объема исследуемых объектов и не связаны с их фармакологическим действием.

Таким образом, исследуемый препарат на основе секретома МСК и носитель в составе препарата (коллагеновый гель) при введении под белочную оболочку семенника кролика обладают приемлемым профилем безопасности.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: А.О. Монакова — дизайн исследования, контроль основных точек экспериментов, написание и редактирование текста рукописи; В.Ю. Балабаньян — дизайн и методология исследования, редактирование текста рукописи; В.А. Вавилова — планирование и проведение исследования, сбор и анализ данных, написание текста рукописи; Н.А. Басалова — подготовка образцов препарата, редактирование текста рукописи; В.С. Попов — дизайн исследования, выбор методов работы с животными; Ж.А. Акопян — идея исследования; А.Ю. Ефименко — идея и планирование исследования, формулировка цели и задач, критический пересмотр текста рукописи.

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Anna O. Monakova designed the study, controlled the main points of experiments, drafted and edited the manuscript. Vadim Yu. Balabanyan designed the study and its methodology and edited the manuscript. Valeria A. Vavilova planned and conducted the experiments, collected and analysed data, and drafted the manuscript. Nataliya A. Basalova prepared medicinal product samples and edited the manuscript. Vladimir S. Popov designed the study and selected the methods for working with animals. Zhanna A. Akopyan conceived the study idea. Anastasia Yu. Efimenko elaborated the study idea, planned the study, formulated the study aims and objectives, and critically revised the manuscript.

Соответствие принципам этики. Проведение исследования одобрено на заседании биоэтической комиссии (БЭК) АО «НПО «ДОМ ФАРМАЦИИ», (протокол заседания БЭК от 27.09.2023 № 1.41/23). Работу с материалом доноров проводили после получения информированного согласия в соответствии с разрешением локального этического комитета (ЛЭК) Университетской клиники МНОИ МГУ имени М.В. Ломоносова, IRB00010587 (протокол заседания ЛЭК от 13.11.2023 № 10/23).

Ethics approval. The study was approved by the Bioethics Committee of the research-and-manufacturing company “HOME OF PHARMACY”, JSC (Meeting Minutes 1.41/23 of 27 September 2023). The work with donor material was performed with informed consent and with permission of the Local Ethics Committee (LEC) of Lomonosov Moscow State University, IRB00010587 (LEC Meeting Minutes 10/23 of 13 November 2023).