Элементные примеси желатиновых капсул: оценка рисков негативного воздействия на организм человека

ВВЕДЕНИЕ

Одной из дозированных лекарственных форм являются желатиновые капсулы, материалом оболочки которых служит медицинский желатин. Данная работа является продолжением исследования, направленного на оценку рисков негативного воздействия элементных примесей желатиновых капсул на организм человека с позиции риск-ориентированной стратегии контроля качества лекарственных средств (ЛС) [1]. В рамках этой стратегии содержание элементной примеси в ЛС сравнивают не со значением предельно допустимой концентрации элемента, которое не зависит от терапевтической дозы ЛС и пути его поступления в организм, а со значением его предельно допустимой суточной концентрации (permitted daily concentration, PDC), которое зависит от этих факторов. Перечень нормируемых элементов в ЛС определяется на основе предварительного скрининга содержания элементов в нем¹.

Ранее [1] мы определили уровень контаминации желатиновых капсул различными элементами и выделили те элементы, для которых необходимо оценить риски негативного воздействия:

1) As, Cd, Hg, Pb — токсичные элементы 1-го класса опасности²;

2) Cr, Cu, Fe, Zn — элементы, содержание которых в соответствии с требованиями отечественных стандартов нормируется в медицинском желатине³;

3) Al, Mn — элементы, требования к содержанию которых в медицинском желатине не установлены, но согласно полученным экспериментальным данным [1] эти элементы присутствуют в желатиновых капсулах в большом количестве.

Для обеспечения безопасности применения лекарственных препаратов в данной лекарственной форме необходимо разработать критерии количественной оценки рисков негативного воздействия этих элементов в желатиновых капсулах на организм человека.

Цель работы — определить значения предельно допустимых суточных концентраций (PDC) элементных примесей в желатиновых капсулах с позиции риск-ориентированной стратегии контроля качества лекарственных средств.

Для реализации цели исследования были поставлены следующие задачи:

1) сравнить фармакопейные требования к содержанию элементных примесей в ЛС в целом и в медицинском желатине и желатиновых капсулах в частности;

2) выявить причины влияния элементных примесей на качество желатина и желатиновых капсул;

3) подготовить рекомендации по нормированию содержания указанных элементных примесей в желатиновых капсулах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для определения значений PDC элементных примесей Al, As, Cd, Cu, Cr, Fe, Hg, Mn, Pb, Zn в желатиновых капсулах проведен анализ собственных экспериментальных данных о содержании элементов в 18 образцах желатиновых капсул различных производителей [1], требований к качеству желатина и/или желатиновых капсул Государственной фармакопеи Российской Федерации (ГФ РФ) XIV и XV изданий, российского государственного стандарта на медицинский желатин⁴, ведущих зарубежных фармакопей: США (USP44–NF39), Британской (ВР 2022), Европейской (EP 11.0), Японской (JP XVIII), Китайской (ChP 2020), Индийской (IP IX). Также проанализированы данные открытых источников научной литературы (без ограничения по дате и типу публикации) о содержании элементных примесей в образцах желатиновых капсул, полученных из технического желатина.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В ГФ РФ XV для оценки неканцерогенного риска (риск роста заболеваемости населения за счет токсичного воздействия на организм токсичных элементных примесей в ЛС) используют такой количественный параметр, как предельно допустимое суточное воздействие (permitted daily exposure, PDE)⁵: доза химического вещества, которая не вызовет негативных последствий, если человек подвергается ее воздействию ежедневно в течение всей жизни⁶. На основе значения PDE рассчитывают предельно допустимую суточную концентрацию вещества⁷:

PDС (мкг/г) = PDE (мкг/сут)/m (г/сут), (1)

где m — масса (количество) ЛС, принятого пациентом в течение суток. При упрощенном варианте расчета PDC элементной примеси m считают равной 10 г.⁸

Для Al, Fe, Mn, Zn значения PDE не установлены (табл. 1), следовательно, для этих элементов отсутствует возможность рассчитать PDC рекомендованным в отечественной фармакопее способом. Содержание элементов с известными значениями PDE (As, Cd, Hg, Pb, Cr, Cu) в капсулах из медицинского желатина [1] не превышало установленные значения PDC. Значения PDC для Cd, Hg, Cr и Сu не превышены и в капсулах из технического желатина [2][3]. Следовательно, значения PDC, единые для элементных примесей ЛС, не всегда могут служить надежным критерием для оценки качества медицинского желатина и желатиновых капсул. Для этих элементов необходим другой подход к оценке предельно допустимого содержания элементных примесей.

Наряду с PDC элементных примесей, единых для большинства ЛС, в фармакопеях различных стран установлены нормы содержания отдельных элементов непосредственно в медицинском желатине. В Российской Федерации показатели качества медицинского желатина дополнительно регламентируются государственным стандартом (далее — ГОСТ 23058-89)⁹. Требования национальных и Европейской фармакопей и государственного стандарта Российской Федерации к содержанию элементных примесей в медицинском желатине не всегда совпадают (табл. 2). Например, ГОСТ 23058-89 предусматривает нормирование содержания в медицинском желатине всех элементов 1-го класса токсичности, а также Cu и Zn, в то время как в ГФ РФ XIV и JP XVIII в перечень нормируемых элементов включены As, Cr, Fe и Zn. Нормы содержания As в медицинском желатине в этих фармакопеях и ГОСТ 23058-89 совпадают, а Zn — различаются более чем в 3 раза.

В JP XVIII помимо монографии «Желатин» включена монография «Очищенный желатин», в этих монографиях различаются требования к содержанию As (не более 1,0 и 0,8 ppm соответственно) и суммы тяжелых металлов (не более 50 и 20 ppm соответственно). В USP44–NF39, ВР 2022, EР 11.0, IP IX нормируется содержание только Cr, Fe, Zn, и представленные в монографиях нормы совпадают с требованиями ГФ РФ. В СhР 2020 помимо монографии «Желатин для капсул», в которой нормируется содержание As (не более 1 ppm), Cr (не более 2 ppm) и тяжелых металлов (не более 20 ppm), присутствуют монографии «Желатин»¹⁰ (нормирует содержание As не более 1 ppm, Cr не более 2 ppm, тяжелых металлов не более 30 ppm); «Полые желатиновые капсулы»¹¹, в которой установлены нормы содержания Cr (не более 2 ppm) и тяжелых металлов (не более 20 ppm); «Кишечнорастворимые полые желатиновые капсулы»¹², в которой содержание элементных примесей не нормируется.

Установленные в нормативной документации на медицинский желатин пределы содержания анализируемых элементов существенно отличаются от PDC этих элементов, единых для ЛС. В медицинском желатине, кроме того, нормируется содержание элементов, для которых не установлены значения PDC (Fe, Zn). Такая ситуация связана, вероятно, с тем, что помимо токсичного действия элементы могут оказывать влияние на качественные характеристики ЛС. Ионы некоторых металлов влияют на свойства коллагена и желатина [4–7], в частности, добавление ионов Al, Cd, Cr, Cu, Fe, Hg, Pb, Zn запускает процесс кластеризации молекул белка за счет комплексообразования с участием ионов металла. Явление образования поперечных сшивок между полипептидными цепями коллагена и желатина получило название кросслинкинга [8].

В работе [5] изучено комплексообразование Cu(II) с коллагеном. Авторы исследования [6] показали, что гидрогели из желатина, сшитые Fe³⁺, Cr³⁺ и Fe²⁺ после выдержки в растворах солей металлов, демонстрируют более высокую механическую прочность за счет более сильной координации по сравнению с исходными гидрогелями. Свойства желатинового гидрогеля резко изменяются в присутствии двухвалентных и, в меньшей степени, одновалентных катионов: в большинстве случаев снижаются модуль упругости, температура плавления и одновременно увеличивается время гелеобразования [7]. Ионы Al³⁺ также вызывают кластеризацию желатина [4]. Эффективное связывание ионов тяжелых металлов с желатином позволило использовать желатиновую матрицу как функциональный биоматериал для иммобилизации металлсодержащих наночастиц (Fe, Cr, Co, Hg и др.) [9].

Технический желатин, как правило, получают из отбракованной кожи. В процессе дубления кожи в качестве дубящих веществ широко применяют основные комплексные соли Сr(III) как самостоятельно, так и в комбинации с другими дубителями, алюмо-калиевые квасцы, а также соли Fe, Zr, Ti. Дубящее действие определяется способностью иона металла образовывать стабильные комплексы, содержащие не менее двух центральных атомов, взаимодействующих с функциональными группами коллагена¹³, то есть именно тем свойством, которое ухудшает качественные характеристики желатина. Можно предположить, что более жесткие требования СhР 2020 к содержанию Cr в желатине для капсул и желатиновых полых капсулах по сравнению с нормами других анализируемых фармакопей обусловлены использованием в Китае хромового экстракта, содержащего K₂Cr₂O₇, в качестве дубящего вещества. Соединения Cr(VI), в отличие от Cr(III), являются канцерогенами с безусловной доказательной базой опасности возникновения опухолей у человека¹⁴. Fe, Cr и Al являются, таким образом, элементными маркерами, высокое содержание которых позволяет дифференцировать медицинский желатин и технический желатин, полученный из отбракованной кожи.

PDC отражает токсичность элемента, которая не зависит от вида лекарственного препарата и пути его поступления в организм. Тот факт, что пределы содержания элементных примесей в нормативной документации на медицинский желатин и желатиновые капсулы значительно отличаются от PDC, единых для большинства ЛС, свидетельствует о том, что разработчики этих норм руководствовались не токсичностью элементов, а их способностью влиять на качество желатина. ГФ РФ XV рекомендует ужесточать требования к PDC элементных примесей, если их содержание на уровне ниже порога токсичности оказывает влияние на качественные характеристики ЛС¹⁵. В этом случае во главу угла ставится риск ухудшения качества ЛС, так как риск токсичного действия примеси при концентрации, превышающей PDC, отсутствует. Если ухудшение качества ЛС происходит при уровне содержания примесей, превышающем порог токсичности, то риск их токсичного воздействия становится определяющим.

Для элементов Cd, Cu, Hg Cr нормы содержания в медицинском желатине существенно ниже, чем соответствующие PDC (в 16,7; 20; 60 и 110 раз соответственно). Следовательно, «сшивание» молекул желатина катионами этих металлов и ухудшение качества препарата происходит на уровне ниже порога их токсичности, и именно этими концентрациями необходимо руководствоваться при оценке качества медицинского желатина. В отличие от PDC, единых для большинства ЛС, эти нормы являются индивидуальными для медицинского желатина и желатиновых капсул (PDC_инд), так как учитывают в первую очередь способность элемента вызывать кластеризацию молекул желатина и ухудшать его качество. Фармакопейные нормы содержания Zn и Fe в медицинском желатине также являются PDC_инд, так как значение PDC для них не установлено. Для указанных элементов в качестве PDC_инд в желатиновых капсулах целесообразно использовать пределы содержания, представленные в ГОСТ 23058-89 «Желатин-сырье для медицинской промышленности» (Cd — 0,03; Cu — 15; Hg — 0,05 мкг/г) и в ФС 2.1.0099.18 «Желатин» ГФ РФ XIV (Cr — 10; Zn — 30 мкг/г).

Для Pb, напротив, величина PDC_инд (2 мкг/г) существенно превышает PDC при пероральном пути введения препарата (0,5 мкг/г), следовательно, при оценке качества желатиновых капсул необходимо руководствоваться токсичностью этого элемента, а не его способностью ухудшать свойства ЛС. При нормировании содержания As в желатиновых капсулах мы предлагаем также руководствоваться значением PDC этого элемента, единого для большинства ЛС (1,5 мкг/г¹⁶), так как As не участвует в кластеризации белковых молекул желатина и предел содержания элемента в данном случае определяется только его токсичностью.

Содержание Fe в образцах желатиновых капсул по данным проведенного нами исследования [1] значительно превышало его PDC_инд (30 ppm, табл. 1). Причиной такого превышения является использование многими производителями желатиновых капсул в качестве красителей оксидов железа. Железо в форме оксида, в отличие от ионов железа, не вызывает кластеризацию макромолекул желатина и не влияет на его качество. Однако методики, основанные на спектральных методах элементного анализа, позволяют оценить только общее содержание Fe в желатиновых капсулах без дифференциации формы, в которой находится этот элемент. В связи с этим целесообразно не включать норму содержания Fe в перечень показателей качества желатиновых капсул, ограничиваясь нормированием его содержания в исходном медицинском желатине.

Отдельной проблемой является определение PDC_инд для Al, так как его содержание в медицинском желатине не нормируется и в ГФ РФ XIV не установлено значение PDЕ. Этот элемент попадает в коллаген (а затем и в желатин) в процессе дубления кожи алюмо-калиевыми квасцами и, так же как катионы тяжелых металлов, вызывает кластеризацию белковых молекул желатина [4]. В соответствии с рекомендациями Международного Совета по гармонизации технических требований к фармацевтическим препаратам для использования человеком (International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use, ICH) PDE можно ориентировочно оценить на основе уровня минимального риска для здоровья (minimal risk level, MRL)¹⁷. MRL определяется как оценка ежедневного воздействия опасного вещества на организм человека, которое, вероятно, не приведет к ощутимому риску неблагоприятных неканцерогенных последствий в течение определенной продолжительности воздействия¹⁸. MRL при пероральном поступлении Al средней продолжительности (15–364 сут) равен 1 мг/кг/сут¹⁹, MRL для Mn при хроническом воздействии (более 365 сут) не установлен. Значение PDE на основе величины MRL рассчитывают по формуле (2)²⁰:

PDE=MRL×W, (2)

где W — средний вес человека (50 кг²¹).

Величина PDE для Al, рассчитанная по формуле (2) с учетом MRL 1 мкг/кг/сут, составляет 50 000 мкг/сут, а значение PDC, определенное по формуле (1), — 5000 мкг/г. Данное значение PDC характеризует токсичность Al, единую для ЛС, но не отражает его способность вызывать кластеризацию молекул желатина и ухудшать его качество.

Для определения PDC_инд Al в желатиновых капсулах на основе его PDC мы предлагаем использовать коэффициент пересчета К, который определяется с помощью данных для элементов с известными PDC и PDC_инд:

К=PDC_инд/PDC. (3)

Значения PDC и PDCинд установлены для элементов Cr и Сu. Для Cr коэффициент пересчета К составил 0,009 (10 ppm²²/1100 ppm²³); для Cu — 0,05 (15 ppm²⁴/300 ppm²⁵). Можно предположить, что такое расхождение в значениях К для Cr и Сu связано с различной способностью этих элементов к комплексообразованию. Согласно теории Льюиса, комплексообразование можно рассматривать как один из видов кислотно-основного равновесия, в котором роль кислоты играет центральный ион (акцептор электронов), а роль основания — лиганды (доноры электронов)²⁶. В соответствии с классификацией кислот Льюиса Al³⁺ и Cr³⁺ относятся к жестким кислотам, Cu²⁺ — к промежуточным, а Cu⁺ — к мягким кислотам Льюиса. Так как Al³⁺, аналогично Cr³⁺, является жестким коплексообразователем, мы рассчитали его PDC_инд, используя значение К для катиона Cr: 5000 мкг/г×0,009=45 мкг/г.

Предлагаемый предел допустимого суточного поступления Al в организм в составе желатиновых капсул (45 мкг/г/сут) хорошо согласуется с экспериментально определенным нами диапазоном его содержания в данном виде оболочек (1,83–36,2 мкг/г [1]).

При литературном поиске нами не обнаружены данные о том, что Mn способен вызывать кластеризацию желатиновых макромолекул, следовательно, предел его содержания в желатиновых капсулах определяется только риском негативного воздействия этого элемента на организм человека. Mn входит в перечень химических веществ, обладающих мутагенной активностью²⁷. Значение MRL для острого, среднего и хронического воздействия неорганического Mn при пероральном пути воздействия не установлено²⁸, следовательно, расчет PCD и, соответственно, прямая оценка риска негативного влияния этого элемента на организм при отсутствии значений PDE невозможен. Мы рекомендуем оценивать этот риск опосредованно, путем добавления в перечень показателей качества медицинского желатина требования к суммарному содержанию тяжелых металлов на уровне 20 мкг/г, как это предусмотрено в JP XVIII на очищенный желатин и СhР 2020 на желатин для капсул.

ВЫВОДЫ

1. Уточнен перечень элементных примесей, подлежащих нормированию в желатиновых капсулах: Al, Cd, Cr, Cu, Hg, Pb, Zn, As.
2. При оценке допустимого содержания элементных примесей в желатиновых капсулах с позиции рисков необходимо учитывать не только токсичность элементов, но и их способность ухудшать качество желатина за счет процессов комплексообразования. Наиболее активными комплексообразователями являются элементы Al, Cd, Cr, Cu, Hg, Fe, Pb, Zn.
3. Для элементов-комплексообразователей, оказывающих влияние на качество желатина на уровне концентраций ниже порога токсичности (Cd, Cu, Hg, Cr, Zn), рекомендовано в качестве пределов их содержания в желатиновых капсулах использовать нормы, установленные в российских стандартах качества на медицинский желатин: Cd — 0,03 мкг/г, Cr — 10 мкг/г, Cu — 15 мкг/г, Hg — 0,05 мкг/г, Zn — 30 мкг/г.
4. Для элементов, не влияющих на качество желатина или влияющих при концентрациях, превышающих порог токсичности (As, Pb), целесообразно в качестве норм их содержания в желатиновых капсулах использовать PDC, единые для большинства ЛС: As — 1,5 мкг/г, Pb — 0,5 мг/г.
5. Рекомендуемая норма содержания Al в желатиновых капсулах (45 мкг/г) рассчитана на основе значения соответствующего MRL и учитывает способность этого элемента к комплексообразованию.
6. Содержание Fe предложено не включать в перечень показателей качества желатиновых капсул, так как его оксиды используются в качестве красителей и не влияют на качество желатина.
7. Для оценки негативного влияния марганца на организм человека предложено включить в перечень показателей медицинского желатина суммарное содержание тяжелых металлов (20 мкг/г).

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: В.M. Щукин — идея, концепция и дизайн исследования; Н.Е. Кузьмина — интерпретация результатов исследования, написание текста рукописи; О.А. Матвеева, Ю.Н. Швецова и Е.С. Жигилей — поиск и анализ данных литературы и нормативной документации.

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Viktor M. Shchukun elaborated the idea, concept, and design of the study. Natalia E. Kuz’mina interpreted the study results and drafted the manuscript. Oksana A. Matveeva, Yulia N. Shvetsova and Evgeniya S. Zhigilei searched and analysed literary data and regulatory documents.